Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: практика

Павел Носырев, Марина Носырева, Татьяна Рассказова, Наталья Корнеева, ОАО "Ай Си Эн Лексредства"

Разработка нормативной документации

Большинство авторов практических рекомендаций по валидации методик сходятся во мнении, что необходимость валидации нужно осознать. Только сознательно и в полном объеме выполняемая работа по валидации методик дает желаемый результат. Тщательное выполнение валидации кажется утомительным, дорогостоящим и длительным занятием. Но многие исследователи уже убедились на практике, что количество времени и ресурсов, требуемых для решения проблем, возникающих впоследствии из-за недостаточно полно проведенной валидации, превышает все возможные затраты на организацию исчерпывающей валидации методики [2, 8]].

За три года практической работы по валидации методик мы в полной мере оценили важность процедуры и документации в данной работе. Первым этапом, как уже говорилось выше, является разработка нормативной документации (стандартной процедуры), детально описывающей проведение процесса валидации. В нашем варианте данная процедура включает следующие разделы:
1. Общие положения: цель, предмет, для кого предназначена;
2. Ответственность различных категорий персонала, участвующих в процессе;
3. Основные требования по безопасности;
4. Описание процедуры (наиболее объемный раздел);
5. Порядок регистрации данных;
6. Порядок пересмотра данной процедуры.

Раздел 4 стандартной процедуры в данной редакции представляет собой методологическую часть, остальные разделы посвящены организационным вопросам. Содержание методологического раздела можно условно представить в виде трех частей: определительная (описание параметров валидации и категорирование методик), процедурная (содержание и процедура составления протокола и отчета о валидации) и регламентирующая (рекомендуемые значения критериев для валидационных параметров).

При определении валидационных параметров мы использовали общепринятые принципы и терминологию, изложенные выше. Для категорирования методик по типам (в зависимости от точности аналитического определения) и, соответственно, дифференцированного подхода к их валидации мы использовали принцип, изложенный в документах ICH и USP [1, 3, 4]].
Методики условно разделяли на 3 категории:
— группа I — количественное определение основных компонентов субстанций, активных ингредиентов (включая консерванты) в ГЛС;
— группа II — определение примесей, родственных веществ, вспомогательных компонентов и пр.;
— группа III — растворение, однородность дозирования в ГЛС.

Составление протокола валидации методик — важнейшая часть процедуры. На этом этапе планируется весь объем эксперимента, предусматриваются условия, определяются значения критериев валидации методик. Примерное содержание протокола:
- вводно-информационная часть (цель, предмет, ответственность, перечень используемой литературы, исполнители, информация о валидируемых методиках);
— методическая часть (условия пробоподготовки, проведения измерений, расчеты и статистическая обработка данных, определение аналитических параметров, исследуемых при проведении валидации);
— заключительная оценочная часть (критерии оценки, выводы, заключение, ревалидация).

При составлении протокола мы подробно излагали материал в каждом разделе, при этом в отчете неизбежно возникали повторения. Но данный подход удобен тем, что каждый отдельный протокол и отчет о валидации методики содержит практически всю информацию, необходимую для оценки правильности процедуры валидации и обоснованности выводов (заключения).
Отчет о валидации в нашем варианте практически полностью повторяет протокол (т.к.  необходимо и в отчете описать все условия проведения процедуры), кроме этого добавляется расчетная часть и результаты валидации в виде выводов и заключения.

Такой подход к регистрации данных на первом этапе освоения методологии валидации аналитических методик кажется нам наиболее целесообразным. В дальнейшем, с накоплением практического опыта, возможно сокращение объема, но не в ущерб объективности.
Изложение методологии валидационного эксперимента логичнее начинать с критериев оценки. Но так как валидация методик проводится по нескольким параметрам, чтобы избежать повторения, мы будем рассматривать эти параметры сразу с точки зрения и выбора критериев, и методологии определения. Последовательность перечисления параметров соответствует последовательности их определения в процессе валидации методик.

Правильность аналитических методик в основном мы определяли анализом модельных смесей с точно известным содержанием аналита. Испытания проводились на 7ё9 модельных смесях с известным содержанием аналита в нормальном ожидаемом диапазоне.
Оценку правильности методики проводили по относительной погрешности. При этом, поскольку в различных объектах содержания аналитов различались, применяли гибкую схему критериев. Так, для методик группы I (количественное определение основных компонентов субстанций, активных ингредиентов в ГЛС) в зависимости от дозировки числовые критерии максимальной и средней погрешностей изменялись (для дозировки менее 50 мг — 8 и 4% соответственно, для дозировки 50ё300 мг — 6 и 3%, для дозировки более 300 мг — 4 и 2%%).

Изменяемость критерия в зависимости от дозировки обусловлена соответствующим изменением допустимого диапазона отклонения дозы [17]. Для методик групп II и III (определение растворения, однородности дозирования, примесей) принимали универсальное значение критерия — средняя относительная погрешность не более 10%%.
В качестве дополнительного критерия правильности применяли статистическую оценку значимости среднего значения относительной погрешности для всех модельных образцов.
При изменении концентрации аналита как для ВЭЖХ, так и для СФ методик погрешность также изменяется. Отличаются средние показатели правильности и для методик различных групп.

Очевидно, что правильность методики в основном определяется двумя факторами: ее специфичностью и степенью извлечения аналита из препарата [10].

 Недостатки методики и в первом случае, и во втором будут проявляться в виде достаточно стабильной систематической погрешности, причем в случае недостаточного извлечения будет наблюдаться занижение результатов определения, а в случае плохой специфичности (мешающее влияние компонентов плацебо) — чаще всего наблюдается завышение результатов определения.

Специфичность аналитических методик определяли по той же схеме, что и правильность, но в этом случае модельные смеси составляли с последовательным введением компонентов плацебо (для выявления возможного влияния каждого компонента). Так как модельные смеси различались, для оценки специфичности рассматривались результаты теста каждой модели. Принцип выбора критериев аналогичен таковому в тесте на правильность.
Результаты испытания специфичности 25 методик ВЭЖХ (различное количество аналита) приведены в табл. 1 (максимальные значения отклонений из всех модельных смесей). В табл. 2 приведены данные по специфичности для методик различных групп.

Приобретая постепенно опыт по валидации методик, мы одновременно изменяли свое отношение к значимости тех или иных параметров. И если вначале мы начинали валидационный эксперимент с определения линейности, сходимости и воспроизводимости, то в последнем варианте стандартной процедуры по валидации методик на первом этапе предусмотрено определение специфичности и правильности, т.к.  именно по этим двум параметрам за все время работ мы получали наибольшее количество отрицательных результатов. В идеальном варианте данные параметры (специфичность и правильность) должны определяться в начальной стадии разработки любой методики.

Линейность и интервал линейности определяли по 9ё11 стандартным образцам с различными концентрациями аналита от 50 до 150% нормального ожидаемого, причем стандарты не содержали компонентов плацебо. Проводили регрессионный анализ данных методом наименьших квадратов. Степень линейности методики оценивали по коэффициенту корреляции, стандартной ошибке определения Y и относительному отклонению каждой точки от регрессионной прямой. Последний параметр также использовали для оценки интервала линейности методики. Критерии оценки линейности методик также устанавливали по «гибкой» схеме.

Пределы обнаружения и количественного определения для методик группы II мы устанавливали в соответствии с рекомендациями [1, 3, 4] методом оценки «уровня шумов» с последующей проверкой на модельных смесях. Данный способ хорошо применим к инструментальным методам анализа, для неинструментальных (ТСХ с визуальной оценкой) сразу проводили анализы серии модельных смесей с различным содержанием аналита.
Оценку уровня шумов проводили, применяя аналитическую процедуру к модельной смеси, содержащей все компоненты плацебо и не содержащей аналита, повторяя ее 10 раз. Затем оценивали средний уровень шумов (стандартное отклонение фонового сигнала). Для предварительной оценки предела определения брали десятикратное значение шума,

для предела обнаружения — трехкратное. Окончательная оценка пределов проводилась определением правильности на модельных смесях, причем критерий соответствия устанавливали такой же, как и во всем интервале метода (погрешность не более 10%). Данный подход, на наш взгляд, более оправдан, чем определение по воспроизводимости [16] или сходимости [2]].

Поскольку в различных препаратах нормируемые содержания примесей, как и процедуры методик, существенно различаются, невозможно выработать критерии по абсолютным значениям чувствительности методик. Мы пользовались относительным критерием: предел определения не должен превышать 20% от нормируемого уровня содержания примеси в препарате, предел обнаружения — не более 25%. Уже на этапе предварительной оценки предела определения по уровню шумов наблюдались существенные различия для методик различных типов. Практика показывает, что высокий уровень предела определения в большинстве случаев напрямую связан с неудовлетворительной специфичностью методик, что вполне логично, т.к.  определяемые концентрации примесей в реальных объектах существенно ниже содержания других компонентов. Это еще раз подтверждает необходимость в первую очередь оценивать специфичность методик и лишний раз показывает преимущество хроматографических методов для данного конкретного применения (определение примесей).

Точность методик определяли на одном из последних этапов валидации. Вначале определяли сходимость, затем — воспроизводимость. В первом случае анализ гомогенной пробы выполнялся 10 раз в одной лаборатории на одном приборе одним аналитиком, во втором — тот же образец анализировали в разных лабораториях разные специалисты на разных приборах и в разное время (всего от 9 до 15 вариантов). Как объект анализа использовали реальные образцы лекарственных препаратов (за исключением методик определения примесей, где в реальные образцы искусственно вводили известное количество примеси в пределах интервала методики).

Оценку проводили по относительному стандартному отклонению результатов анализов одного образца. Как и в случаях правильности, специфичности и линейности, применяли гибкую шкалу критериев. Для методик группы I допустимые значения sr принимали от 1,5 до 3% в зависимости от дозировки ЛС, для методик группы II — не более 10%, для методик группы III — не более 5%. Такие уровни кажутся нам наиболее обоснованными и хорошо согласуются с рекомендациями, приведенными в различных источниках [2, 3, 5]. Как и ожидалось, при определении точности аналитических методик наблюдается обратная зависимость относительного стандартного отклонения результата анализа от концентрации аналита. В зависимости от назначения методики также наблюдаются различия в результатах испытаний.

Испытания методик на точность дают еще один очень полезный практический результат: найденное стандартное отклонение методики легко преобразуется в доверительный интервал результата анализа.

Последний используется для расчета так называемых «границ гарантированного качества». То есть, определяется значение анализируемого показателя, которое дает определенную вероятность (например, 99%), что истинное значение находится в рамках, установленных НД. Таким образом, решается проблема «вечного камня преткновения» лабораторий ОКК и производства: выпускать или не выпускать продукцию на нижнем или верхнем пределе НД. Теперь можно обоснованно предъявлять требования: показатель должен быть выше нижнего предела (или ниже верхнего) на величину доверительного интервала (та самая ожидаемая неопределенность результатов измерений, о которой говорилось в первой части).

Устойчивость методик мы определяли проведением тестов правильности на модельных смесях с изменениями условий проведения анализов, либо проведением анализов реальных объектов в измененных условиях с последующим сравнением результатов с аналогичными, полученными в нормальных условиях. В обоих случаях результаты испытаний выражались в виде относительной погрешности. Критерии, как и в предыдущих случаях, устанавливали в зависимости от групп методик: 2,5ё5,00% для методик группы I и 10% для групп II и III. Если в результате испытаний обнаруживали зависимость результатов анализа от изменения определенных условий, это не означало непригодность методики, а только обусловливало в дальнейшем особые предосторожности.

За исключением отдельных случаев по отдельным параметрам (существенные изменения рН, температуры и т.п.) большинство исследованных нами методик показывало достаточно высокую устойчивость к небольшим отклонениям параметров. Очевидно, что данный показатель больше определяется индивидуальными особенностями методики и мало зависит от таких факторов, как количество аналита в матрице или определяемый показатель. На наиболее многочисленной группе исследованных нами методик (группа I) мы наблюдали для ВЭЖХ методик относительную погрешность до 4%, для спектрофотометрических — до 5%%.

Подводя итог пока еще относительно короткому, но достаточно плодотворному пути нашей практической деятельности по освоению процесса валидации методик, можно отметить ряд положительных эффектов как в решении данной проблемы, так и в работе аналитических лабораторий в целом. Во-первых, отработана процедура, и мы приступили к этапу разумного сокращения объема эксперимента и документации. Во-вторых, мы обрели уверенность в методиках, что положительно сказалось как на работе отдела контроля качества, так и на производстве. Кроме того, валидационный эксперимент действительно оказался хорошей школой для персонала лабораторий, что отчетливо наблюдается уже на самом процессе валидации: если 2 года назад в самом начале валидация одной методики занимала от 2 до 3 месяцев, то сегодня мы валидируем до 3 методик в месяц (не считая эксперимента предвалидации, выполняемого при разработке методик).

www.remedium.ru