Цветовая дифференциация недугов

Каждому из нас хорошо известно, что для проведения простейшего анализа приходится идти в поликлинику, сидеть в очереди, а потом нервничать и еще несколько дней ждать, чтобы получить в конце концов клочок бумаги с каракулями, которые может прочитать только дипломированный врач (и вновь сидишь в очереди в коридоре поликлиники)... Во многих медицинских учреждениях до сих пор все именно так и делается — дешево и сердито.

Что же, нельзя по-другому? Нет, есть и другой, куда более быстрый, способ проведения анализов. Образцы крови, взятой у пациента, готовит квалифицированный лаборант в специально оборудованной лаборатории, а затем еще более квалифицированный инженер проводит анализ подготовленных образцов с помощью высокотехнологичного прибора, купленного за полмиллиона долларов. Для серьезных научных исследований — обычное дело, но для повседневных клинических анализов — дороговато.

Можно все организовать и проще и дешевле. Диабетик время от времени смотрит на вживленный в кожу миниатюрный датчик. Если цвет датчика изменился, значит, уровень глюкозы не в норме, пора делать инъекцию инсулина. Даже маленький ребенок поймет, что об изменении цвета «пятнышка» на коже надо сообщить родителям. Этот удобный и недорогой метод — не идея писателя-фантаста. Разработка такого датчика уже несколько лет ведется в Техасском университете A&M.

Описанные сценки дают представление о том, на что будет похоже прохождение клинических (да и не только клинических) анализов в самом скором будущем: с одной стороны, будет продолжаться повышение чувствительности и точности методов, требующих квалифицированного персонала и дорогостоящей техники, а с другой — появление простых, дешевых и в силу этого широко распространенных методов.
Найти вредителей

Причинами многих болезней, в первую очередь врожденных или хронических, являются нарушения на молекулярном уровне (оставим в стороне огнестрельные и ножевые ранения). Проще говоря, болезни возникают из-за недостатка или избытка определенных молекул в тех или иных тканях и органах. Естественно, достоверная диагностика таких болезней требует проведения биохимических анализов — «идентификации личности» определенных молекул и определения их количества. Специалистам известны и «приметы преступников», молекулярные маркеры широчайшего круга болезней — от ревматоидного артрита до злокачественных опухолей.
 
Четырехкомпонентый биосенсор, разработанный в Пенсильванском университете, будет использоваться в американской армии. С его помощью можно будет вовремя обнаружить опасное повышение концентрации глюкозы, лактозы, кислорода и молочной кислоты в крови. Фото: Craig Grimes, Penn State

Еще более важны биохимические анализы для оценки состояния организма в данный момент. Хрестоматийный пример — проблемы в области обмена веществ, в частности, уже упоминавшийся сахарный диабет: когда содержание глюкозы в крови становится слишком высоким, необходимо делать инъекцию гормона инсулина. После инъекции «усвоение» глюкозы клетками улучшается, но вводить инсулин «на всякий случай» тоже плохо — может произойти резкое падение уровня глюкозы.

Сейчас в мире более 180 миллионов диабетиков, и их количество, по прогнозам ВОЗ, будет стремительно расти. А это значит, что уже сейчас существует огромный неудовлетворенный спрос на простые «домашние» способы контроля глюкозы в крови. Поэтому миллионы долларов инвестируются в разработку средств биохимического анализа «на дому».

Для диагностики инфекционных болезней (к примеру, гриппа, герпеса, гепатита) также необходимо опознать болезнетворного агента. Здесь ситуация еще сложнее: точная диагностика часто требует идентификации определенного штамма или типа возбудителя именно на молекулярном уровне. Дело в том, что опасные и безвредные штаммы могут отличаться только структурой определенных молекул. Например, среди десятков разновидностей вируса папилломы есть и безвредные, и вызывающие рак матки. Различаются они только особенностями (поэтому при папилломах применяют «ДНК-диагностику»).

Для диагностики и многих других болезней, а также при анализе продуктов питания, донорских материалов, лекарственных препаратов и многих других объектов необходимо «опознание» определенных молекул среди бесконечного разнообразия очень похожих. «Свидетелями», которые опознают «подозреваемые» молекулы, обычно служат специально полученные белки-антитела или ДНК-зонды. Каждый из них имеет уникальную пространственную структуру и связывается только со своей молекулой-мишенью («распознает» ее), аналогично тому, как каждый ключ подходит только к «своему» замку. Однако одного «опознания» мало — «свидетели» должны подать сигнал о том, что встретили «подозреваемого» (ученые называют такие молекулы «мишенями»), и в этом главная сложность. Чтобы узнавание можно было зарегистрировать,

надо пометить молекулу-«свидетель», которая будет распознавать молекулу-«подозреваемого».
Плохой молекуле — «черную метку»

Легче всего пометить радиоактивным изотопом — тогда можно детектировать ничтожные количества «мишени». Так и делали лет 10–40 назад. Но этот метод влечет за собой массу проблем: подходящие изотопы недешевы, желающих каждый день работать с радиоактивными материалами найти непросто, использованные изотопы надо куда-то девать, а самое главное — вводить изотопы в организм пациента в диагностических целях тоже, мягко говоря, не очень полезно...

Хотелось бы найти какие-то другие способы пометить молекулы. В настоящее время главной альтернативой изотопам являются ферменты — белковые молекулы, способные многократно ускорять какую-либо строго определенную химическую реакцию. В анализируемые образцы добавляют специально синтезированное вещество — субстрат фермента, который под действием данного фермента превращается в другое вещество, окрашенное. В результате о наличии «подозреваемого» в образце сигнализирует постепенно проявляющееся окрашивание образца. Окрашивание можно определить на глаз или зарегистрировать с помощью несложного прибора — «ридера».

Но не все так просто. Ферменты — большие, сложные и нестабильные молекулы. Их получение — дорогостоящая процедура. Ферменты весьма капризны. Они могут терять свою активность (способность ускорять химическую реакцию) под действием многих химических веществ — ингибиторов, при нагревании или просто при хранении при температуре выше минус 20°С.

Существенные преимущества перед ферментативными метками имеют флуоресцентные молекулы, способные светиться под действием внешнего освещения. По чувствительности современные флуоресцентные метки приближаются к изотопным и ферментативным конкурентам, но при этом — дешевы, безвредны, стабильны. В отличие от радиации, не обязательно использовать сложное оборудование для их детекции. В принципе, сигнал можно оценивать невооруженным глазом. Но и флуоресцентные метки, использовавшиеся до самого последнего времени, имеют существенные недостатки.
 
Примерно так выглядит пространственная структура одного из белков-«свидетелей» конкавалина А. Он всегда готов «настрочить донос» на моносахарид глюкозы — маннозу. Иллюстрация: Protein Data Bank

Главный из них в том,

что не всегда строго выполняется правило «чем больше "мишени" в образце, тем ярче флуоресценция». Яркость «подсветки» может меняться под действием многих факторов: из-за изменения яркости света, которым освещают образец; метки со временем разрушаются; многие вещества, содержащиеся в крови или тканях человека, в большей или меньшей степени тушат флуоресценцию (то есть в их присутствии происходит уменьшение интенсивности). К тому же биологические образцы имеют сложный и заранее неизвестный состав, соответственно, в них также могут находиться вещества, которые влияют на флуоресценцию.

Другие параметры флуоресценции менее «капризны», чем интенсивность, но требуют более сложного оборудования для регистрации. В научно-исследовательских институтах со всеми этими недостатками разобраться несложно, но для повседневных анализов в поликлинике или на дому у пациента этот метод не подходит.

Еще один принципиальный недостаток изотопных, ферментативных и простейших флуоресцентных меток в том, что их сигнал (радиация, появление окрашенного вещества, интенсивность флуоресценции) не зависит от того, произошло ли «узнавание» мишени мечеными молекулами. Поэтому после смешивания образца и меченых молекул необходимо отделить те меченые молекулы, которые связались с мишенью, от «лишних», не связанных с мишенью. Процедура отделения усложняет анализ и является потенциальным источником ошибок.
Цвет выявит угрозу

Принципиально новое решение предоставляют молекулы, которые были разработаны в последние годы при сотрудничестве ученых Страсбургского университета (Франция), Научного института генной инженерии и биотехнологии (Турция) и других научных центров в Европе — так называемые двухволновые флуоресцентные зонды (по химической номенклатуре — 3-гидроксифлавоны и 3-гидроксихромоны).

Можно сконструировать такие молекулы, которые будут менять цвет флуоресценции пропорционально количеству разыскиваемого вещества. Если в анализируемом образце есть молекула-«подозреваемый», то новый зонд меняет не интенсивность флуоресценции, а цвет. Это значит, что на результат не повлияет ни случайное изменение количества зонда в образце из-за спонтанного разрушения молекул при хранении или из-за ошибки лаборанта, ни изменение яркости источника света. В этом случае не потребуется и специальная лампа в измерительном приборе — хватит и света от естественных источников.

 
Использование двухволновых флуоресцентных молекул делают ненужным избавление от лишних «свидетелей». Более того, оно было бы даже бесполезным. Двухгорбая форма графика сохраняется при изменении концентрации. Иллюстрация автора:

Способность менять цвет излучения в зависимости от наличия молекулы-«подозреваемого» придает двухволновым флуоресцентным молекулам свойства сенсоров: регистрируемый сигнал «образуется» сразу при контакте молекулы-сенсора с определяемым веществом. Благодаря этому не потребуется удаление избытка меченых молекул, которые не связались с «подозреваемым». Более того, сигнал двухволновых зондов (цвет) не влияет так называемое неспецифическое тушение флуоресценции (то есть вызванное наличием веществ, которые не интересуют аналитика), которое часто является проблемой при использовании других параметров флуоресценции. При работе с двухволновыми зондами тушение не является помехой: оба «горба» на спектре уменьшаются одинаково, но их отношение (то есть цвет флуоресценции) остается неизменным.
Когда это будет возможно?

Современный уровень науки позволяет узнать очень многое о том, что делается в организме конкретного человека, но многие ли готовы заплатить за такую информацию кругленькую сумму? Геном человека (конечно, не конкретного человека, а биологического вида) расшифрован от начала до конца, но для этого десятки ведущих научных центров на протяжении десяти лет тратили миллионные бюджеты.

Вспомним историю распространения компьютеров: электронно-вычислительную машину изобрели еще в 1940-е годы, однако глобальная компьютеризация произошла только после того, как ЭВМ превратилась из монстра, занимающего сотни квадратных метров, в маленький ящик на письменном столе. Аналогичную революцию можно ожидать и в области знаний о собственном организме, когда точные методы анализа не будут избыточно сложными и безумно дорогими.

Пока мы знаем только один пример такого средства анализа, которое стало общедоступным — это тест на беременность, выполненный в виде полоски бумаги. Однако научные достижения последних лет, в том числе двухволновые флуоресцентные зонды, делают возможной разработку большого количества методов для достоверной и быстрой клинической диагностики буквально «на глаз», без дорогих приборов и радиоактивных меток. Подождем еще…

Сергей Авилов