Токсична ли молекула фуллерена С60?, или к вопросу: "какой свет будет дан фуллереновым нанотехнологиям - красный или все-таки зеленый?"

Тезисы критических заметок по поводу некоторых поспешных наблюдений и выводов о свойствах различных водных дисперсий наночастиц фуллерена С₆₀

Андриевский Г.В^©., Клочков В.К., Деревянченко Л.И.
Институт Терапии АМН Украины, 2-а, пр. Постышева, 61039, Харьков, Украина.

Открытое письмо (русская версия) Copyright © Октябрь 2004

 

«Измениться ли безвредная суть
активированного угля, если его
смешать с цианистым калием?»

В последнее время в научной и в общественной прессе, в частности в газете Нью Йорк Таймс, в Интернете (слова для поиска = "фуллерен (fullerene)" и "токсичность (toxicity)"), появился ряд сообщений по биологическим испытаниям неких водных дисперсий C₆₀ фуллерена, которые ставят под сомнение безопасность для живых организмов и для окружающей среды чистых фуллеренов в целом [1,2,3,4,5].

Ниже мы приводим ряд критических замечаний по поводу причин, которые обусловливают отрицательные биологические эффекты сложных коллоидных дисперсий C₆₀.

В свою очередь, мы приводим также ряд аргументов и доказательств, которые свидетельствуют о том, что чистые фуллерены не являются токсичными, а супрамолекулярная система "фуллерен-вода" обладает широким спектром положительной биологической активности.

1.

Прежде всего следует отметить то, что наша группа является пожалуй одной из немногих в мире, которая на протяжении более 10 лет систематически занимается как получением водных дисперсий фуллеренов, так и изучением их физико-химических и биологических свойств. За этот период времени по материалам наших исследований было опубликовано более 30-ти статей в престижных научных жуналах, а также сделано более 60-ти научных сообщений на различных международных конференциях. Обширный круг исследований систем “фуллерены - вода” проводится нами в сотрудничестве со многими ведущими научными организациями, круг которых постоянно расширяется.

2.

Обсуждаемые дисперсии получают, например, путем смешивания раствора C₆₀ в органическом растворителе с водой, причем выбирается такой растворитель (как правило - полярный), который сам способен хорошо растворяться в воде [3,5,6,7,8].

Ранее мы предпринимали попытки получить водные фуллереновые дисперсии с использованием растворов C₆₀ или в тетрагидрофуране (ТГФ) [см. напр. 9 и ссылки в ней], или в N-метил-пирролидоне (НМП), или в других полярных растворителях. Однако, мы отказались использовать подобные дисперсии для биологического тестирования по многим причинам, в т.ч. и потому, что они состояли из частиц с непостоянным составом. Наряду с этим такие частицы содержали много как органического растворителя (т.е. они были подобными кристаллосольватам), так и иных примесей. Все это, в конечном итоге, могло извращать истинные биологические свойства чистых фуллеренов.

Также мы убедились, что типично кристаллические nC₆₀ дисперсии в воде невозможно получить с помощью "простого" смешивания раствора C₆₀ в органическом растворителе с водой. Причина этому - образование донорно-акцепторных комплексов C₆₀ с полярными молекулами органических растворителей [10,11,12 и соотв. доп. ссылки там], которые препятствуют формированию типичных кристаллических структуры C₆₀.

3.

Тем не менее, недавно методика получения водных дисперсий nC₆₀ или "nano-C₆₀" фуллеренов, с которыми работают E. Oberdorster и V. Colvin (Rice University, USA), и которые описаны в их статьях [3*,5], была воспроизведена нами четырежды. Получены стабильные растворы с концентрациями 40 мг/л и больше (вплоть до 390 мг/л) (образец №1 на рис.1). Изучены основные свойства, и, основываясь на данных работ [9,13], проведен сравнительный спектрофотолюминесцентный анализ. В основном эти дисперсии являются сходными с теми, которые известны из литературы [напр., 8,14].

4.

E. Oberdorster, V. Colvin and S. Deguchi используют очень сходные методические подходы, что приводит к образованию сложных дисперсных частиц с размерами 30 – 100 нм. При этом, такие дисперсные частицы содержат около 10 % вес. органических примесей (напр., ТГФ). Тогда, простой расчет дает молярное соотношение ТГФ/C₆₀ ³ 1, т.е. в коллоидной частице, фактически, в кристаллосольвате, на одну молекулу C₆₀ приходится минимум 1 молекула органического растворителя и, следовательно, эти частицы нельзя обозначать, как nC₆₀!

Также известно, что такие частицы не экстрагируются толуолом из водной фазы. Подобная ситуация может быть только в том случае, если поверхность частиц покрыта прочным слоем, состоящем из молекул воды. Этот слой не позволяет молекулам толуола непосредственно контактировать с C₆₀, и поэтому фуллерены не могут перейти из водной фазы в органическую [9,13,15].

Поэтому формулу обсуждаемых частиц можно записать, как (nС₆₀*xM)*mH₂O, где M – молекула органического растворителя и, что не исключено, продукты ее каталитического расщепления, деградации.

Таким образом, дисперсии, изучаемые by E. Oberdorster, V. Colvin and S. Deguchi [2,3,4,5,8] не являются водными дисперсиями нанокристаллических частиц чистого C₆₀ фуллерена, а их физико-химические и биологические свойства, естественно должны отличаться принципиальным образом от аналогичных характеристик чистого C₆₀ как в мономолекулярном, так и в нанокристаллическом состоянии!

5.

Как общее замечание, стоит отметить, что данные авторы приводят явно недостаточный круг физико-химических характеристик дисперсий nC₆₀ и “nano-C₆₀”, для того, чтобы иметь ясное представление о их химическом составе. Например, отсутствует важная информация о полных ИК-спектрах свежеосажденных коллоидных частиц.

Дополнительно к этому стоит указать, что в статьях, посвященных различным водным дисперсиям фуллеренов, присутствует распространенное заблуждение, связанное с интерпретацией причины появления в УФ-вид спектрах C₆₀ широкой полосы поглощения в диапазоне 400-500 нм. Наличие этой полосы часто используют для доказательства кристалличности наночастиц C₆₀. Действительно, эта полоса обнаруживается в спектрах достаточно толстых пленок C₆₀, но она также появляется в спектрах растворов донорно-акцепторных комплексов (ДАК) C₆₀ с различными молекулами (M) [9,10,11,12 и соотв. ссылки в них].

В целом, появление этой полосы поглощения обусловлено переносом заряда с молекулы донора электронов (C₆₀ или M) на молекулу C₆₀ с образованием слабых ДАК, типа C₆₀^d+C₆₀^d- или M^d+C₆₀^d-, соответственно.

Таким образом, наличие в УФ-вид спектрах C₆₀ широкой полосы поглощения в диапазоне 400-500 нм не должно использоваться в качестве аргумента для доказательства кристаллического состояния C₆₀!

6.

Что касается подозрительных токсических эффектов дисперсий V. Colvin, обнаруженных в экспериментах с рыбами [3], то удивление вызывает сильное отрицательное действие на мозг рыб при отсутствии негативных влияний на их печень и жабры. Более того, в сравнении с контрольными экспериментами, и в печени, и в жабрах рыб негативные процессы (перекисное окисление липидов) уменьшились благодаря активации антиоксидантных процессов.

Другими словами, детоксицирующие системы рыб не среагировали отрицательным образом на малые концентрации некоего “яда”, но мозг его почувствовал. Обычно, столь избирательным действием обладают игаляционные наркотики (напр. диэтиловый эфир). С другой стороны, известно, что ТГФ обладает сравнимым с диэтиловым эфиром наркотизирующим действием, но является значительно более токсичным, чем последний. Поэтому, можно полагать, что отрицательное влияние дисперсий Colvin связано с наличием в них ТГФ.

То, что в Colvin’s дисперсии присутствовали существенные количества или ТГФ, или иных неизвестных примесей подтверждается необычно высоким поглощением в УФ-спектре в диапазоне 200-220 нм [рис.4 в ссылке 3], которое, в соответствие с работой S. Deguchi [рис.1 в ссылке 8], должно быть в несколько раз меньшим.

Дополнительным подтверждением наших сомнений служит и тот факт, что дисперсные частицы (nС₆₀*xM)*mH₂O не экстрагируются неполярным растворителем – толуолом. Следовательно, такие частицы не являются липофильными и поэтому они вряд ли будут способными избирательно накапливаться в липидобогатых тканях и клетках мозга, и, следовательно, не должны влиять, непосредственно, на функции последнего. Тогда причину обнаруженных отрицательных эффектов следует объяснять наличием в дисперсиях, именно, ТГФ и продуктов его модификации, но не фуллеренов.

Для оценки этого авторам следовало бы провести соответствующие контрольные эксперименты. Без них выводы о токсичности C₆₀ фуллеренов являются некорректными и преждевременными!

7.

В отличие от выше обсуждаемых дисперсий, высокостабильные водные молекулярно-коллоидные растворы фуллеренов (FWS, образцы 2 и 3, рис.1), в зависимости от концентрации, содержат как единичные гидратированные фуллерены (HyFn, C₆₀@nH₂O, n=22-24), так и их лабильные кластеры, ассоциаты, с размерами 3-36 нм [9,16,17,18] .Максимальная концентрация HyFn в C₆₀FWS, которую удается достичь, составляет около 5.5*10^-3 моль/л (4 г/л) [патенты Украины N 27669 от 15.09.2000 и N 29540 от 15.11.2000, патент РФ N 2213692 от 16.07.2002]. При этом разбавление концентрированных FWS водой способствует диссоциации крупных кластеров до мелких, вплоть до образования растворов, состоящих только из единичных гидратированных фуллеренов [19] (рис.2).

8.

Что касается более, чем 10-ти летних биологических испытаний FWS в различных in vitro и in vivo экспериментах, то они не выявили каких-либо токсических эффектов C₆₀HyFn (при концентрациях от 10^-9 до 10^-4 моль/л и при суммарных дозах вплоть до 25 мг/кг). При этом, наряду с отсутствием у C₆₀HyFn иммуногенных и аллергенных свойств [20,21], наблюдались только позитивные биологические эффекты (Табл 1).

Нетоксичность HyFn нормально коррелирует со многими хорошо известными фактами об отсутствии токсических эффектов для чистых C₆₀ (солюбилизированных сурфактантами и микронизированных с помощью ультра измельчения) [22,23,24], в том числе вводимых животным в дозах вплоть до 2,

5 г/кг [25].

9.

Что касается прооксидантных свойств C₆₀HyFn, то, в отличие от кристаллических форм C₆₀, они не способны генерировать сильные оксиданты – реактивные формы кислорода (РФК = ¹O₂ - синглетный кислород, O₂^.-- - супероксидный радикал и т.п.) потому, что их прочная гидратная оболочка не позволяет молекулярному кислороду (O₂) непосредственно сорбироваться на поверхности молекулы C₆₀. Наоборот, C₆₀HyFn проявляют «разумную» и долговременную антиоксидантную активность, вероятно, за счет достаточно универсального механизма регуляции уровня свободных радикалов в водной среде, что определяется свойствами упорядоченных водных структур (рис. 3). Вероятно, именно в этой особенности заключается отличие гидратированных С₆₀ фуллеренов от многих известных антиоксидантов, как жирорастворимых, так и водорастворимых [26,27,28,29,30,31].

К этому стоит добавить извесные факты о том, что чистый C₆₀ обладает сравнимой или даже большей антиоксидантной активностью, чем у природного антиоксиданта витамина Е (a-токоферол) [32], а также демонстрирует мощную гепатопротекторную активность, т.е. защищает печень от токсических повреждений [33].

10.

Суммируя сказанное, является несомненным, что негативные биологические эффекты фуллереновых дисперсий, обнаруженные в работах E. Oberdorster and V. Colvin (при концентрациях C₆₀ прибл. 3*10^-8 - 5*10^-6 моль/л), связаны с наличием в нанодисперсиях C₆₀ большого количества примесей – молекул органического растворителя и продуктов деградации последних.

В этом смысле, водные дисперсии фуллерена С₆₀, с которыми имеют дело S. Deguchi, V. Colvin, E. Oberdorster и другие (например, P. Scharff, Yu.I. Prilutskyy с соавт. [34]), отличаются от FWS по очень многим принципиальным показателям и, в т.ч., по внешнему виду (рис. 1)!

Дополнительные доказательства этому можно найти в новой статье V. Colvin с соавторами [5], в которой, со ссылкой на наши работы [9,16] и работы S. Deguchi [8], авторы говорят, что они тестировали на токсичность некие водные коллоиды “nano-C

₆₀”, которые, вроде бы, подобны нашим FWS. Но, даже, простое сравнение данных электронной микроскопии коллоидных “nano-C₆₀” (четкие кристаллоподобные частичы с размерами в среднем 60 нм) [5] и гидратированных C₆₀ фуллеренов (сфероподобные ассоциаты HyFn с размерами 3-36 нм) [16] уже является прямым доказательством того, что при исследовании токсичности фуллеренов группа V. Colvin имеет дело с совершенно другими объектами, которые являются полностью отличными от FWS!

Как ни странно, группе V. Colvin не удалось также воспроизвести в полной мере и дисперсии, которые описаны в статье S. Deguchi с соавт. [8].

11.

Но, опять-таки, нас и многих наших коллег удивляют факты летального действия на человеческие клетки кожи (фибробласты) дисперсий V. Colvin, содержащих очень малые концентрации C₆₀ (прибл. 10^-8 моль/л) [5].

С одной стороны, исследования T Moriguchi с соавторами [35] не выявили сколько-нибудь существенных поражений кожных покровов мышей под воздействием повторных аппликаций толуольного раствора C₆₀ с одновременным облучением УФ-светом.

С другой стороны,

наши многолетние контакты с водными растворами HyFn не выявили ни каких повреждающих, раздражающих и т.п. эффектов для кожи. Более того, мы неоднократно отмечали, что наружное применение как сверхнизких, так и высоких концентраций HyFn способствует ускоренному заживлению мелких ран, язв и ожогов кожных поверхностей. Такие эффекты были особенно выражеными, когда совместно с HyFn применялись стандартные бактерицидные средства.

Как и в случае с результатами работы E. Oberdorster, подробный анализ работы V. Colvin с соавторами не вызывает сомнения, что многие странные эффекты, в т.ч. и негативные, выявленные при тестировании (nС₆₀*xM)*mH₂O дисперсий, так или иначе связаны со свойствами молекул органического растворителя – ТГФ. Например, с их способностью как образовывать перокси-соединения, так и повышать текучесть и проницаемость фосфолипидных мембран клеток.

Более того, обсуждаемые кристаллосольватные наночастицы, после сорбции на поверхности живой клетки, будут создавать локально высокие концентрации (в сравнении с объемными) токсичных молекул M, что будет отрицательно влиять как на функции клеточной мембраны, так и, естественно, на жизнеспособность клетки в целом.

12.

В то же время, несмотря на недостатки обсуждаемой статьи [5], и, если не принимать во внимание факты о «токсичности» дисперсий “nano-C₆₀”, в данной работе прослеживается интересная закономерность, обнаруженная для водорастворимых производных C₆₀.

А именно, чем больше на сферической поверхности C₆₀ имеется присоединенных химических групп, чем более симметрично они располагаются на ней (т.е. чем более заполненным и более симметричным является окружение фуллереновой поверхности), тем меньше становится токсичность химических производных C₆₀ (см. рис.1 в ссылке [5]).

HyFn, который состоит из молекулы C₆₀, окруженной прочной и высокосимметричной гидратной оболочкой [9,19] (рис.1), можно рассматривать как предельный случай такой закономерности и поэтому HyFn должен обладать минимальной токсичностью, или не иметь таковой вовсе. Данное предположение отлично коррелируют с отсутствием какой-либо токсичности HyFn, что было подтверждено экспериментально (Табл.1).

13.

Однако, анализируя положительные биологические эффекты, которые вызывают малые концентрации HyFn (10^-9–10^-7 моль/л) [26,30,31] (Табл. 1), возникает интересная проблема. Она связана с вопросом, что же есть реальная причина, которая обуславливает такие эффекты?

Исследуя большую совокупность биологических эффектов, которые проявляют HyFn при очень малых концентрациях и при сверхмалых дозах (например, в гомеопатических), мы пришли к выводу, что эти эффекты обусловлены не столько самой молекулой C₆₀, сколько, главным образом, стабильными структурами так называемой близкосвязанной воды и последующими упорядоченными гидратными оболочками, которые окружают молекулу C₆₀ (рис.1). При этом в этих оболочках упорядоченность и некоторые свойства воды являются отличными от тех, которыми обладает обычная объемная вода. Более того, мы имеем ряд фактов, которые свидетельствуют о том, что структуры и свойства воды, которая или же окружает C₆₀ в HyFn [17], или же прилегает непосредственно к поверхности важнейших биологических структур (ДНК [36], белки [37], ферменты, мембраны клеток [26] и т.п.) [38], являетются схожими. Такие сходства могут быть дополнительным объяснением причин отсутствия каких-либо негативных эффектов действия HyFn на биологические объекты. Только положительные (Табл.1)!