Биохимические процессы, лежащие в основе свободнорадикального окисления, механизмы антирадикальной защиты, оценка их эффективности у онкологических больных

Илларионов М.Ю.
Врач ординатор отделения анестезиологии-реанимации 1.
Краевая клиническая больница 4, центр грудной хирургии. Россия, г. Краснодар

Материал не несет коммерческого интереса, основан на данных многочисленных авторов, проказаны механизмы анти-радикальной защиты, приведены данные об активности антиоксидантов и схема их применения. Цель - обратить внимание на применение витаминотерапии и показать ее эффективность.

Лекарственная терапия, антибиотики, хирургические вмешательства, нервные переживания и стресс - все это вносит дополнительный вклад в углубление витаминного голода. Нарастающий дефицит витаминов, нарушая обмен веществ, усугубляет течение любых болезней, препятствует их успешному лечению.

Строение клеточной стенки:

В трансмиссионном электронном микроскопе она представляется трехслойной структурой, состоящей из двух плотных листков, каждый толщиной от 2 до 3 нм, разделенных менее плотным слоем, толщиной от 4 до 5 нм. Общая толщина мембраны составляет от 7,5 до 10 нм. Наружная поверхность ее представлена толстым слоем мукополисахаридов (гликокаликс). Внутренняя поверхность связана с элементами цитоскелета клетки и сформирована лабильными белками, которые обеспечивают целостность микрофиламентов и микротрубочек.
Средний слой мембраны состоит из двух рядов молекул фосфолипидов, расположенных более или менее перпендикулярно к поверхности мембраны, так что их неполярные (гидрофобные) концы соприкасаются друг с другом, а полярные (гидрофильные) обращены к водным растворам по ту или другую сторону мембраны.

Нормальная проницаемость цитомембраны главное условие в гомеостазе клетки. При повреждении цитоплазматической мембраны нарушается её проницаемость, нарушается мембранный транспорт, коммуникации клеток и их "узнавание", изменения подвижности мембран и форма клеток, нарушения синтеза и обмена мембран, что проявляется в виде деформации или атрофии специализированных структур, появлением щелей или разрывов. Это приводит к быстрому набуханию клеток за счет поступления большого количества воды, распаду их цитоскелета. Меняется проницаемость мембраны для ионов натрия и калия и в клетке накапливается жидкость.

В каждой клетке нашего организма, каждое мгновение происходят с той или иной скоростью бесконечные процессы распада и синтеза, процессы восстановления и окисления различных групп химических веществ. Среди этих миллиардов химических превращений происходит образование некоторых химических веществ, которые по тем или иным причинам не окислились или не восстановились до конца. Эти вещества, состоящие из особых групп атомов или молекул, имеют очень высокую реакционную способность, так как содержат неспаренные (не прореагировавшиее) электроны на внешних электронных уровнях. Эти группы атомов и молекул получили название свободные радикалы.

Свободные радикалы - очень нестабильные частицы с нечетным числом электронов на внешней орбите, содержащие активированный кислород, вступающие в реакцию с липидами мембраны клетки (перекисное окисление липидов) в результате которой происходит его разрушение, нарушается проницаемость, освобождается избыточная энергия, а все это в свою очередь ведет к разрушению всей клетки.

Свободные радикалы образуются при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (загрязнённая атмосфера, табачный дым, гипоксия у больных с заболеваниями легочной системы; радиация, химические соединения, попадающие в организм с пищей и т. д.). Такие молекулы стремятся отнять электрон у других полноценных молекул, вследствие чего пострадавшая молекула сама становится свободным радикалом, и таким образом, развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку человека.
Еще в 1954 году Доктор Денхам Харман, профессор в отставке университета Небраски, высказал идею о связи причины развития некоторых заболеваний с повреждающим действием свободных радикалов на организм человека. Спустя сорок лет эта теория стала ведущей, объясняя причины возникновения и развития более шестидесяти видов различных заболеваний.

К ним можно отнести такие грозные болезни, как рак, атеросклероз, стресс, астма, артроз, варикозное расширение вен, болезни печени, почек, гипертензии, нарушение памяти, сахарный диабет и другие.
Дело в том, что свободные радикалы повреждают клетки, которые в результате этого теряют способность к делению и выполнению своих биологических функций.

Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, провоцировании воспалительных процессов в мышечных, соединительных и других тканях, неправильном функционировании различных систем организма: циркуляционной, нервной (включая клетки мозга) и иммунной систем. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран.

Основные механизмы нарушения барьерных свойств липидного слоя

Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, эритроциты) показало, что, в конечном счете, существует всего четыре основных процесса, которые непосредственно обусловливают нарушение целостного липидного бислоя в патологии [Владимиров Ю. А., 1973]:

перекисное окисление липидов;
действие мембранных фосфолипаз;
механическое (осмотическое) растяжение мембраны;
адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды.

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов
Реакции, в которых образуются свободные радикалы
Перекисное окисление липидов - пример процесса, идущего с участием свободных радикалов. Свободные радикалы - это молекулярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью.

Таблица 1. Свободные радикалы, образующиеся в клетках нашего организма
Радикал Основной источник Вредные реакции
Первичные радикалы:

Семихиноны Цепи переноса электронов HQ + O2 -> Q+ O2- + H+
Супероксид Клетки-фагоциты O2- + Fe3+ -> O2 + Fe2+
Монооксид азота(NO) Клетки эндотелия и многие другие NO + O2- -> OONO- (пероксинитрит)

Вторичные радикалы:

Радикал гидроксила H2O2 + Fe2+ -> Fe3+ + HO- + HO (реакция Фентона)
HOCl + Fe2+ -> Fe3+ + Cl- + HO (реакция Осипова) Повреждение ДНК и РНК, цепное окисление липидов
Радикалы липидов Цепное окисление липидов Повреждение липидного бислоя и мембранных ферментов
Радикалы антиоксидантов Цепное окисление липидов Иногда оказывают прооксидантное действие
Радикалы, образующиеся при метаболизме ксенобиотиков Промышленные токсины и некоторые лекарства
Образование вторичных радикалов
Радикалы, образующиеся при действии света Поглощающие свет вещества Образование вторичных радикалов

Первичные радикалы

Основные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы ненасыщенных жирных кислот, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Радикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и в ходе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, одно время применявшихся в качестве лекарств.

Активные формы кислорода

Основная масса молекулярного кислорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно восстанавливается до воды, окисляя органические субстраты в цепях переноса электронов. Меньшая часть кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислорода восстанавливается клетками нашего организма до супероксидного радикала. Так клетки фагоциты (моноциты и гранулоциты крови и тканевые макрофаги) выделяют супероксид в реакции, катализируемой ферментным комплексом НАДФН-оксидазой:

НАДФН + 2O2 -> НАДФ+ + 2O - (супероксид)
Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной.
В норме и при отсутствие ионов металлов переменной валентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водорода; эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой (СОД) :
2O - -> H2O2 + O2
Клетки-фагоциты используют перекись водорода, превращая ее в гипохлорит соединение, разрушающее стенки бактериальных клеток; эта реакция катализируется ферментом миелопероксидазой :
H2O2 + Cl- -> H2O + ClO-
Избыток перекиси водорода удаляется под действием двух ферментов: глутатионпероксидазы или каталазы:


В условиях патологии могут произойти нарушения либо системы защитных ферментов (в частности, снижение активности супероксиддисмутазы), либо ферментных систем, связывающих ионы железа в плазме крови (церулоплазмин и трансферрин) и в клетках (ферритин). В этом случае супероксидные радикалы и перекись водорода вступают в альтернативные реакции: Образование двухвалентного железа из трехвалентного :

Fe3+ + O - -> Fe2++ O2
Реакция перекиси водорода и гипохлорита с ионами двухвалентного железа :
Fe2+ + H2O2 -> Fe3+ + HO- + HO (радикал гидроксила)
Fe2+ + ClO- + H+ -> Fe3+ + Cl- + HO (радикал гидроксила)

Совокупность продуктов, образуемых активированными клетками-фагоцитами (радикалы супероксида и гидроксила, перекись водорода и гипохлорит) называют активными формами кислорода. Радикалы гидроксила химически исключительно активны и вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов биологических мембран. Особенно тяжелые последствия имеют две последние реакции. Радикалы OH вызывают разрыв нитей ДНК, обладая, в зависимости от ситуации, мутагенным, канцерогенным или цитостатическим действием. С другой стороны, реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы гидроксила инициируют цепную реакцию их пероксидации (перекисного окисления).

Цепное окисление липидов

Реакция протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи.

Инициирование цепи

Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы:

HO + LH -> H2O + L
Липидный радикал (L ) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO ):
L + O2 -> LOO
Продолжение цепи
Радикал LOO атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L :
LOO + LH -> LOOH + L
Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов
Разветвление цепи

Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями липидов:

Fe2+ + LOOH -> Fe3+ + HO- + LO
Образующиеся радикалы LO инициируют новые цепи окисления липидов:
LO + LH -> LOH + L ;
L + O2 -> LOO -> и т. д.
Обрыв цепей

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом:

LOO + Fe2+ + H+ -> LOOH + Fe3+
LOO + InH -> In + LOOH
LOO + LOO -> молекулярные продукты + фотон

Последняя реакция интересна еще и тем, что она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность "сверхслабого" свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале, и измерение хемилюминесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах, изучения образования активных форм кислорода клетками крови и перитонеальными макрофагами.

Биологические последствия пероксидации липидов

Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют "оксидативным стрессом") сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток.

Таблица 2. Наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов
Действие перекисного окисления на мембранные белки Действие перекисного окисления на липидный слой мембран
Окисление тиоловых соединений

Повреждение переносчиков

Появление проницаемости для ионов

Повреждение транспортных АТФаз Увеличение микровязкости мембран

Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов

Уменьшение гидрофобного объема

Увеличение полярности липидной фазы

Увеличение проницаемости для ионов водорода

Увеличение проницаемости для ионов кальция

Окисление тиоловых групп мембранных белков

Этот процесс может приводить в результате к неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты:

Pr-SH + L -> LH + Pr-S
Pr1-S + Pr2-S -> Pr1-SS- Pr2
Pr-S + O2 -> Pr-SO2 -> производные сульфоновой кислоты

Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Ca2+-АТФазы. Инактивация этого фермента приводит к замедлению "откачивания" ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран:

1 - Изменение свойств липидного слоя
2 - Увеличение микровязкости мембран
3 - Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов
4 - Уменьшение гидрофобного объема
5 - Увеличение полярности липидной фазы
6 - Увеличение проницаемости для ионов водорода
7 - Увеличение проницаемости для ионов кальция

Увеличение проницаемости для ионов кальция второй результат перекисного окисления липидов связано с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Так показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирование разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического голода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры. Третий (и быть может, самый важный) результат пероксидации это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций.

Клеточные системы антирадикальной защиты

В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа. Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цепных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций протекают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется в липидной фазе, а часть - в водной фазе. В зависимости от этого можно говорить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах.

Таблица 3. Наиболее известные антиоксиданты
Церулоплазмин (плазма крови) Окисляет Fe2+ до Fe3+ молекулярным кислородом
Апо-белок трансферрина (плазма крови) Связывает Fe3+
Ферритин (цитоплазма) Окисляет Fe2+ и депонирует Fe3+
Карнозин Связывает Fe2+
Супероксиддисмутазы (повсеместно) Удаляет супероксид с образованием пероксида водорода
Каталаза (внутри клеток) Разлагает пероксид водорода с выделением кислорода
Глутатион-пероксидазы (в цитоплазме) Удаляет пероксид водорода за счет окисления глутатиона
Удаляет гидроперекиси липидов
Глутатионредуктаза Восстанавливает окисленный глутатион
Токоферол, тироксин, стероиды Перехватывают радикалы липидов
Аскорбиновая кислота Регенерирует окисляющиеся токоферол и убихинон
Глутатион Используется для восстановления пероксидов

Свободные радикалы в неспецифическом иммунитете и воспалении

Формирование свободных радикалов - важный защитный механизм, лежащий в основе неспецифического иммунитета: фагоцитоз приводит к многократному увеличению содержания свободных радикалов в фагоцитирующих клетках с одновременным повышением потребления кислорода в 20 и более раз (т.н. "дыхательный взрыв").