Полиморфизм гена фактора свертывания VII и риск инфаркта миокарда у больных с ишемической болезнью сердца

Доменико Джирелли, Карла Руссо, Паоло Феррарези, Оливьеро Оливьери, Мирко Пинотти, Симонетта Фризо, Франко Монцато, Алессандро Мацукко, Франческо Бернарди, Роберто Коррочер
Отделение клинической и экспериментальной медицины и Институты клинической химии и сердечно-сосудистой хирургии при Университете Вероны; Отделение биохимии и молекулярной биологии Университета Феррара, Италия

Обоснование исследования Высокий уровень фактора свертывания VII в плазме, как полагают, связан с повышенной вероятностью смерти от ишемической болезни сердца (ИБС). Концентрация его, а значит, и риск тромбоза коронарных артерий, ведущего к инфаркту, отчасти зависит от того, какой вариант гена определяет выработку данного фактора.

Методы В исследование было включено 444 пациента, у 311 из которых наблюдался тяжелый, подтвержденный при ангиографии атеросклероз. У 175 из этих 311 больных в прошлом был диагностирован инфаркт миокарда. Контрольную группу составили 133 пациента с нормальными данными коронарографии. Мы определили уровни активированного фактора VII и проанализировали 3 возможные разновидности вариантов гена фактора свертывания VII: по промотору (аллели А1 и А2), по каталитическому региону (R353Q) и по интрону 7.

Результаты Вариации внутри указанных разновидностей гена влияли на уровни фактора VII. У больных с генотипами А2А2 и QQ наблюдался наиболее низкий уровень активированного фактора VII (соответственно, на 66% и 72% ниже, чем у пациентов с генотипом "дикого" типа). Доли различных генотипов были аналогичными в группе больных без ИБС и в популяции пациентов с этим заболеванием. В последней из упомянутых популяций среди лиц, никогда не страдавших инфарктом миокарда в анамнезе, было значительно больше гетерозигот и гомозигот по аллелям А2 и Q, чем среди лиц, перенесших это заболевание (Р=0,008 для вариантов промотора и Р=0,01 для вариантов R353Q, по данным анализа X²). Показатель расхождения в частоте инфаркта миокарда среди больных с генотипами А1А2 или RQ по сравнению с эталонными генотипами составил 0,47 (95% доверительный интервал 0,27-0,81).

Выводы Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при определенных генотипах фактора VII снижена вероятность инфаркта миокарда. Это может объяснить, почему у некоторых больных не развивается это заболевание, несмотря на выраженный атеросклероз коронарных артерий.

Тромбоз лежит в основе наиболее острых проявлений атеросклероза коронарных артерий, в том числе, инфаркта миокарда [1]. Разрыв бляшки, и, как следствие, контакт тканевого фактора с кровью и его связывание с циркулирующим фактором свертывания VII [2, 3] считается главной причиной тромбоза при инфаркте миокарда. За последние 20 лет большое место отводилось изучению роли фактора VII при ишемической болезни сердца (ИБС). По данным Исследования сердца в центре Northwick Park, высокие концентрации фактора VII в плазме указывают на повышенный риск смерти от этого заболевания [4]. Такую же закономерность выявили и некоторые другие исследовательские группы [5, 6], но нс все [7, 8]. На уровни в плазме фактора VII оказывают влияние как внешние воздействия, так и генетические особенности [9]. Понуляционные исследования показали, что до 1/3 разнообразия в уровнях фактора VII, возможно, обусловлены двумя распространенными разновидностями вариантов гена фактора свертывания VII:
1) замещением глютамина на аргинин в положении 353 каталитического участка (domain) (R353Q) и
2) и включением 10-bр в область промотора (promoter) (5'F7) [10].

Ген фактора свертывания VII также характеризуется полиморфизмом за счет разнообразного числа повторений 37-bр в интроне 7 (IVS7) [11]. Редкие аллели каждой разновидности данного гена, как правилo, связаны со сниженным уровнем фактора VII.

Интерес к полиморфизму гена фактора свертывания VII в последнее время повысился благодаря исследованию, построенному по принципу "случай-контроль" [12], в котором было показано, что наличие определенных аллелей может значительно влиять на риск инфаркта миокарда. Однако другие работы не выявили такого влияния [13, 14]. Wang и соавт. [15] нe нашли связи между вариантами R353Q и тяжестью коронарного атеросклероза по данным ангиографии. С другой стороны, как известно из биологии, фактор VII влияет не на развитие коронарного атеросклероза, a только на его тромботические осложнения, а именно, на инфаркт миокарда.

Не так уж редко в клинической практике встречаются больные, у которых при ангиографии выявляется выраженный атеросклероз, но инфаркт миокарда не развивается. Уже многое известно о (факторах риска инфаркта, однако значение факторов с потенциально защитными свойствами до конца еще не изучено. Мы проанализировали частоту нескольких вариантов гена фактора свертывания VII у больных, которым была выполнена коронарография. Наша основная цель состояла в том, чтобы выяснить, имеется ли при выраженном атеросклерозе зависимость между типом аллеля и частотой инфаркта миокарда. Мы также изучили связь между вариантами гена фактора свертывания VII и концентрациями активированного фактора VII (VIIa) в крови.

Методы

Популяция исследования

Критерии для набора популяции в нашей работе уже были изложены детально [16]. Если изложить их кратко, мы обследовали 444 не состоявших в родстве друг с другом взрослых пациентов обоих полов. Их отобрали последовательно из тех больных, которые направлялись в Институт сердечно-сосудистой хирургии Университета Вероны (Италия). Из этих 444 пациентов у 311 при ангиографии был выявлен тяжелый атеросклероз с поражением нескольких коронарных артерий. Поэтому они считалось кандидатами для шунтирования этих артерий. Классификация на две группы - с инфарктом миокарда в анамнезе или без него - осуществлялась с помощью опроса больных и тщательного поиска в медицинской документации характерных электрокардиографических изменений или повышения уровней ферментов, либо типичных признаков перенесенного инфаркта при ангиографии желудочков. Достаточная документация была получена у 285 из 311 пациентов (91,6%); 175 составили группу перенесших инфаркт миокарда, а у 110 не было этого заболевания. Тяжесть атеросклероза определялась но числу коронарных артерий со стенозом более 50% от диаметра их просвета. Ангиограммы оценивались двумя кардиологами, которые не знали, что больные участвовали в исследовании. У большинства пациентов с атеросклерозом коронарных артерий (у 76%) это заболевание носило выраженный характер с поражением всех трех самых крупных коронарных артерий. У 18 больных были поражены 2 сосуда, а у 6 - один.

Контрольную группу составили 133 пациента, которых обследовали не по поводу возможной патологии коронарных артерий, а по другим причинам (в большинстве случаев - в связи с патологией клапанов). У них были нормальные коронарные артерии по данным ангиографии, не отмечалось проявлений атеросклероза в анамнезе, а также клинических или лабораторных признаков этого заболевания в других сосудах. Эта контрольная группа служила для того, чтобы ясно определить атеросклеротический фенотип и выявить связь между различными вариантами гена фактора свертывания VII и коронарным атеросклерозом.

Все пациенты, вошедшие в исследование, были из северной Италии; группы характеризовались сходным социально-экономическим и этническим составом. Во время забора крови у всех больных собирался полный анамнез, включая информацию о наличии или отсутствии таких факторов риска, как курение, гипертония и сахарный диабет. Пациенты, принимавшие антикоагулянты, исключались из изучения корреляции генотипа и фенотипа. Данная работа была одобрена наблюдательными комитетами наших институтов. Все пациенты после соответствующего разъяснения дали либо письменное, либо устное согласие на участие в исследовании.

Биохимические анализы и определение фактора VIIa

Венозная кровь забиралась у каждого больного после воздержания от приема пищи в течение 1 ночи.

У пациентов, которым планировалось шунтирование коронарных артерий, кровь для анализа брали за несколько дней до операции. Липиды сыворотки и другие показатели риска тяжелых сердечно-сосудистых осложнений, включая уровень гомоцистеина, определяли по описанным ранее методикам [16].

Кровь набиралась в вакуумные пробирки, содержащие 0,1 часть 0,129М буферного циртата натрия на 10 частей крови. Фактор VIIa определялся в плазме с помощью растворимого, рекомбинантного, усеченного (truncated) тканевого фактора (Staclot VIIa-rTF, Diagnostica Stago, Asnieres-sur Seine, Франция) [17]. Результаты выражались в тысячных долях единицы на миллилитр (мЕд/мл), 30 таких единиц эквивалентны 1 нг фактора VIIa. Коэффициент вариации в пределах одного анализа составлял 7,8%, а коэффициент вариации между различными по времени анализами - 6,4%.

Анализ и номенклатура мутаций

ДНК получали из лимфоцитов периферической крови фенол-хлороформным методом. Анализ для выявления трех разновидностей вариантов гена фактора свертывания VII осуществлялся по методике, описанной ранее [18]. Первая разновидность - 5'F7, она обусловлена внедрением дикамера в положении 323 в области промотора 5', причем аллель А1 соответствует отсутствию этого дикамера, а аллель А2 - его внедрению. Вторая разновидность - R353Q, она связана с замещением гуанина на аденин в кодоне группы 353 эксона 8, что приводит к замене аргинина (R) на глютамин (Q). Третья разновидность - IVS7, включающая разнообразное число тандемных повторений 37-bр (от 5 до 8) в гипервариабельном участке 4 интрона 7, причем аллель а (также называемая Н7) соответствует наличию 7 мономеров [12], аллель b (Н6) - 6 мономеров, аллель с (Н5) - 5 мономеров, аллель d (Н8) - 8 мономеров.

Статистический анализ

Все вычисления производились с помощью программы SPSS (версия 7.5.21, SPSS, Чикаго). Распределение непрерывных переменных величин в группах выражали в виде: [срeдняя вeличина]+/-[стандартное отклонение]. Логарифмическое преобразование проводилось на всех отклоняющихся от прямой линии (skewed) переменных, включая уровень фактора VIIa. Различия в количественных переменных оценивались на статистическую достоверность с помощью непарного t-теста по Student. Качественные показатели анализировались с помощью теста X². Уровни фактора VIIa сравнивались между отдельными пациентами с различными вариантами его гена с помощью анализа вариации, применяя методику Tukey для итогового многофакторного сравнения средних величин. В каждой из двух групп пациентов (с патологией коронарных артерий или без нее) показатели частоты аллелей и генотипов, связанных с каждым из тpex вариантов разновидностей гена, сравнивались с помощью теста X² и величин, предсказанных на основании уравнения Hardy-Weinberg. Генотипы анализировались с учетом числа возможных величин (по 3 для промотора и для R353Q; 6 для IVS7). Для суждения о том, насколько связаны различные аллели и генотипы с коронарным атеросклерозом или с инфарктом миокарда, применялась логистическая регрессия, при этом подсчитывался показатель расхождения (odds ratio) с 95% доверительными интервалами. Аллели А2, Q и а сравнивали по их клиническому значению, соответственно, с аллелями "дикого" типа A1, R и b, которые использовались как эталон. При подсчете показателя расхождения (отражающего степень риска) для каждого генотипа применяли две (или в случае разновидностей IVS7 более, чем две) ложные (dummy) переменные, при этом А1А1, RR и bb служили эталоном. Поправка на пол и курение делалась путем включения этих ковариантов во второй набор в моделях многофакторной логистической регрессии.

Результаты

Характеристики больных представлены в таблице 1. Как и ожидалось, у пациентов с ИБС было больше основных факторов риска тяжелых сердечно-сосудистых осложнений,

чем у больных без этого заболевания. В соответствии с результатами предыдущего исследования [18], наблюдалось значительная неравномерность вo взаимосвязях разновидностей гена, особенно между 5'F7R и R353Q. Все 12 больных с генотипом QQ также имели генотип А2А2, остальные 6 пациентои с А2А2 имели генотип RQ.

Анализ корреляции генотипа и фенотипа проводили по данным общей популяции больных после того, как были исключены пациенты, принимавшие антикоагулянты во время забора крови или за несколько дней до него. Урoвень фактора VIIa в плазме существенно зависел от всех типов разновидностей гена (таблица 2). Средняя концентрация этого фактора при генотипе А2А2 была на 66% ниже, чем при А1А1, а при генотипе QQ - на 72% ниже, чем при RR; при гетерозиготности по этим аллелям средние его уровни были промежуточными. Что касается полиморфизма по IVS7, средние концентрации фактора VIIa были самыми низкими при генотипе аа, самыми высокими - при ас и промежуточными - при других генотипах с этими аллелями. Анализ вариации показал, что уровни фактора VIIa значительно ниже при гомозиготности по aa, чем при гомозиготиости пo bb (в среднем на 34%). Из-за небольшого числа больных с очень редкими аллелями с и d, статистический анализ уровней фактора VIIa, связанных с наличием этих аллелей, не дал достоверных результатов.

Таблица 1. Характеристики основной и контрольной групп больных*

Характеристика	Пациенты с ИБС (N=311)	Контрольная группа (N=133)	Показатель P	Пациенты с ИБС и инфарктом миокарда (1) (N=175)	Пациенты с ИБС без инфаркта миокарда (1) (N=110)	Показатель P
Возраст (годы)	61,3+/-8,8	57,5+/-13	0,002	60,3+/-8,7	61,6+/-8,4	0,36
Мужчины (% больных)	87,6	51,5	<0,001	89,5	77,0	0,007
Индекс массы тела (2)	26,2+/-2,9	24,8+/-3,3	<0,001	26,4+/-3,1	26,3+/-3,0	0,80
Холестерин сыворотки (ммоль/л)
Общий	6,16+/-1,1	5,62+/-1,1	<0,001	6,2+/-1,1	6,0+/-1,2	0,16
ЛВП	1,25+/-0,3	1,49+/-0,4	<0,001	1,2+/-0,3	1,3+/-0,4	0,10
ЛНП	4,18+/-1,0	3,63+/-0,9	<0,001	4,3+/-0,9	4,0+/-1,1	0,10
Триглицериды сыворотки (ммоль/л)	2,14+/-1,7	1,47+/-0,7	<0,001	2,1+/-1,8	2,2+/-1,7	0,66
Фибриноген плазмы (г/л)	3,55+/-0,8	3,32+/-0,8	0,01	3,5+/-0,8	3,4+/-0,6	0,32
Гомоцистеин плазмы (mмоль/л)	15,7+/-1,4	13,8+/-1,4	0,02	15,6+/-1,5	15,7+/-1,5	0,80
Курильщики (% больных)	71,0	44,0	<0,001	74,7	62,6	0,04
Гипертония (% больных)	69,8	42,1	<0,001	61,7	58,2	0,70
Сахарный диабет (% больных)	13, 2	5,9	0,04	11,8	16,2	0,30
Фактор плазмы VIIa (мЕд/мл) (3)	43,8 (41,0-46,5)	40,8 (36,2-46,0)	0,33 (40,0-47,9)	44,0 (38,0-47,0)	42,5	0,50 0,89
Число стенозированных сосудов (% больных)
Один	6			6	6
Два	18			20	17
Три	76			74	77

ИБС - ишемическая болезнь сердца; N — число больных; ЛВП - липопротеины высокой плотности; ЛНП - липопротеины низкой плотности.
Для перевода уровней холестерина в мг/дл следует разделить приведенные значения на 0,02586. Для перевода концентра­ций триглицеридов в мг/дл разделите величины в таблице на 0,01129.
* Значения со знаком "+/-" - это средние величины +/- стандартное отклонение.
(1) У 285 из 311 пациентов с ИБС была получена документация, достаточная для определения, был ли у них инфаркт мио­карда или нет.
(2) Индекс массы тела равен весу в килограммах, разделенному на квадрат роста в метрах.
(3) Значения концентраций фактора плазмы VIIa представляют собой геометрические средние, в скобках даны 95% довери­тельные интервалы.

Таблица 2. Концентрации в плазме фактора VIIa у пациентов в популяции исследования в зависимости от разновидностей вариантов гена фактора свертывания VII *