ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК В ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

И.А. Балдуева

ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ, Санкт-Петербург

источник RosOncoWeb.Ru

"Вакцинотерапия - метод, основанный на использовании антигена или комплекса антигенов в сочетании или без адъювантов для модуляции иммунного ответа" (Restifo N., Sznol M., 1997). Это метод активной специфической иммунотерапии, в основе которой лежит стимуляция иммунного ответа пациента на свою собственную опухоль. Вакцинация (вакцинотерапия) при раке может использоваться с адъювантной (после хирургического лечения при отсутствии клинически определяемых отдаленных метастазов) и лечебной целью (в случае диссеминации опухоли).

Многочисленными работами последних десятилетий показано, что при злокачественных опухолях нет адекватного иммунного ответа. Это может быть обусловлено несколькими причинами:

1) недостаточная иммуногенность опухолевого/опухолеасоциированного антигена;
2) способность опухоли вызывать местную или системную иммунодепрессию (интерлейкин-10, трансформирующий фактор роста-?, фактор роста эндотелия сосудов и др.) со снижением активности Т-лимфоцитов;
3) нарушение механизма представления опухолеасоциированного антигена.
В 70-е годы прошлого столетия Hewitt et al. (1976) было высказано предположение, что экспериментальные опухоли у линейных животных в большинстве случаев оказываются неиммуногенными. Результаты клинических исследований также показали, что опухоли у человека мало отличаются от нормальных тканей. Последнее обстоятельство может отчасти объяснить отсутствие эффективной активации иммунной системы. Вследствие этого было сформулировано заключение о том, что иммунологические вмешательства в опухолевый процесс являются малоперспективными. В последующем в работах van Pel и Boon (1982) на мышиных моделях было показано, что защитный иммунный ответ может быть индуцирован против "неиммуногенных опухолей", а недостаточная иммуногенность обусловлена скорее неспособностью опухоли активировать иммунную систему, чем отсутствием на ее поверхности опухолевых антигенов. Эти наблюдения впоследствии были подтверждены на неиммуногенных опухолях экспериментальных животных других видов, где с помощью манипуляций иммунной системой (другими словами - вакцинаций) было показано, что опухолевые антигены присутствуют и на неиммуногенных опухолях и могут эффективно стимулировать иммунную систему для элиминации опухоли. Эти данные, судя по всему, могут быть экстраполированы на опухоли человека. Таким образом, опухоли всех локализаций могут быть чувствительными к иммунологическому вмешательству (Boon, 1996; van der Bruggen, 1996; Rosenberg S., 1999).

Клинические исследования по изучению активной специфической иммунотерапии больных с опухолями различных локализаций проводятся в настоящее время во всех онкологических центрах мира. Объектами исследования являются вакцины на основе аутологичных или аллогенных не модифицированных и модифицированных опухолевых клеток, синтетические поливалентные вакцины, вакцины на основе дендритных клеток и др.

Известно, что свободные (несвязанные) антигены не распознаются Т-лимфоцитами даже в том случае, если эти клетки экспрeссируют рецепторы соответствующие антигену. Для того чтобы инициировать иммунный ответ, антиген должен быть представлен на поверхности антиген-представляющей клетки в контексте с HLA молекулами и в ассоциации с другими поверхностными молекулярными структурами (костимулирующие, адгезивные и др.). Это событие является определяющим как в стимуляции Т-клеток, так и в формировании эффективного иммунного ответа (Guinan E., 1994). Т-клетки "памяти" могут инициировать иммунный ответ в более короткий срок при взаимодействии с различными антиген-представляющими клетками (В-клетки, макрофаги, дендритные клетки), из которых дендритные клетки (ДК) способны к индукции первичного ответа непраймированными Т-клетками. К основным свойствам ДК относятся:

1) уникальная способность собирать Т-клетки на своей поверхности за счет наиболее высокой экспрессии собственных молекул главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR, -DP и -DQ) и молекул I класса;
2) способность при созревании экспрессировать молекулы CD80, CD86 и CD40, которые активируют соответствующие лиганды на Т-клетках - CD28, CTLA-4 и CD40L;
3) способность продуцировать ряд цитокинов, включая интерлейкин-12, который увеличивает иммунологический ответ за счет "направления" Т-клеток по пути дифференцировки их в Т-хелперы 1-ого типа;
4) способность захватывать растворимые антигены с помощью эндоцитоза;
5) наличие эффективных механизмов для обработки (процессинга) сложных белков до иммуногенных пептидов;
6) способность выполнять высокодифференцированную роль в тимусе: индуцируют толерантность к собственным тканевым антигенам с помощью удаления развивающихся аутореактивных Т-клеточных клонов и др.
Как показали исследования, количество ДК в организме больных злокачественными опухолями снижено, а сами они функционально неполноценны. ДК, выделенные из периферических лимфоидных и нелимфоидных тканей и периферической крови как экспериментальных животных с опухолями, так и онкологических больных не способны стимулировать специфический ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и слабо стимулируют Т-хелперы (Bernard J. et al., 1997; Gabrilovich D. et al., 1996; Zitvogel L. et al., 1996). Кроме того, на их поверхности было выявлено снижение экспрессии адгезивных и костимулирующих молекул, а также критическое снижение экспрессии HLA-молекул, особенно I класса. Предполагается, что уменьшение количества ДК и потеря ими ряда функций может быть одной из главных причин отсутствия полноценного иммунного ответа на развивающуюся опухоль.

Культивирование периферических ДК in vitro в условиях, позволяющих получить их максимальный рост и активацию, приводило к увеличению экспрессии поверхностных молекул, но уровень их часто оказывался недостаточным для индукции устойчивого ответа специфических ЦТЛ (Gabrilovich D. et al., 1996). Наибольшей способностью по сравнению с периферическими ДК к представлению специфического опухолевого антигена Т-лимфоцитам обладают костномозговые предшественники ДК, а также сингенные или аллогенные ДК из периферической крови здоровых индивидуумов, активированные in vitro опухоль-ассоциированными антигенами (Palmer E. et al., 1997; Reid C., 1997). Только такие ДК в большинстве случаев стимулировали нормальный ответ ЦТЛ. Это позволяет считать активированные ДК перспективными кандидатами для активной специфической иммунотерапии пациентов с распространенными формами злокачественных опухолей, в том числе и резистентных к стандартному лечению.

Формирование эффективного противоопухолевого иммунного ответа на вакцинотерапию, как правило, требует от нескольких недель до нескольких месяцев. Поэтому клинический эффект активной специфической иммунотерапии является отсроченным (Jefford M. et al., 2001). Понятно, что этот метод должен быть более эффективным при применении с адъювантной целью в случае так называемой резидуальной опухолевой болезни. При большой опухолевой массе эффективность вакцинотерапии a priori значительно ниже, так как в этих случаях часто наблюдается недостаточное проникновение в опухоль клеток-эффекторов, генерированных в результате вакцинации.

Вакцинотерапия может быть неэффективной у пациентов с быстрым опухолевым ростом, так как при прогрессировании злокачественные опухоли генетически нестабильны (следствие мутаций), и это может способствовать "уклонению" новых опухолевых клонов от распознавания иммунной системой хозяина. Поэтому многие клинические исследования ДК-вакцинотерапии проводятся на пациентах с минимальной остаточной болезнью. Это связано с решением таких важных задач как увеличение выживаемости и безрецидивного периода. Вместе с тем применение современных методов иммунотерапии у больных с диссеминированными опухолями, устойчивыми к традиционным методам лечения, помогают более полно понять эффективность иммунологического ответа, биологию опухолевого роста, а также определить место иммунотерапии в комплексном лечении онкологических больных.

При разработке методов вакцинотерапии большое значение имеют лабораторные тесты, результаты которых могут прогнозировать клиническое течение заболевания. К ним относится: исследование специфических пептид-HLA-тетрамеров, внутрицитоплазматического интерферона-?, ELISPOT-тест (enzyme-linked immunospot), полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы (Sznol M. & Marincola F., 2000). Эти тесты позволяют определить количество антиген-специфических Т-клеток в периферической крови и способность Т-клеток повреждать клетки-мишени, экспрессирующие чужеродный антиген.

Большие споры вызывает вопрос о выборе материала для лабораторного исследования при оценке ответа на вакцинотерапию: периферическая кровь, опухолевая ткань или дренированные лимфатические узлы. Определение содержания антигенспецифических эффекторных клеток в циркулирующей крови отмечено как наиболее значимое. Вместе с тем важным остается изучение связи лабораторных показателей и отсроченного регресса опухоли. С практической точки зрения наибольшее значение имеют клинические методы оценки лечебного эффекта (полный, частичный регресс, стабилизация процесса и их продолжительность).

В настоящее время рассматриваются различные типы миелоидных ДК, которые могут быть пригодными для клинического использования: ДК, выделенные из периферической крови, выращенные ex vivo из их костномозговых предшественников (CD34+-гемопоэтические стволовые клетки), полученные из моноцитов периферической крови. Тип ДК - это определенная стадия созревания гемопоэтической клетки за пределами костного мозга, в которой важная роль отводится типу антигенной стимуляции. Встреча с иммуногенным антигеном способствует их созреванию или активации и может изменять функцию (например, миграцию, стимуляцию Т-клеток, продукцию цитокинов и др.).

Одновременно оцениваются различные методы доставки антигена для ДК ex vivo. Для активации ДК используют специфические пептиды, но их применение ограничено в связи с зависимостью от HLA фенотипа пациента (Nestle F., 2000). При некоторых опухолях опухолеассоциированные антигены остаются неизвестными, поэтому используется лизат цельных опухолевых клеток (Ashley D. et al., 1997), пептиды, элюированные с поверхности аутологичных опухолевых клеток, конъюгаты "ДК-опухолевая клетка" (Hart I. & Colaco C., 1997). РНК и ДНК опухолевой клетки также могут быть трансфицированы в ДК с целью синтеза антигенного опухолевого белка и/или представления на своей поверхности иммуногенных пептидов (Nair S. et al., 1998; Philip R. et al., 1998). Противоопухолевым эффектом обладают также экзосомы, которые представляют собой "антиген-представляющие пузырьки", полученные из опухолевых клеток или ДК (Zitvogel L. et al., 1999).

В последнее время установлено, что выбор типа ДК для клинического применения зависит от типа антигена (Serody J. et al., 2000). ДК процессируют антиген, который может быть доставлен как пептид, белок или генетическая вакцина. Незрелые ДК, которые активно используют эндоцитоз и эффективно захватывают экзосомы, могут быть наиболее подходящими для доставки иммуногенного белка или антигенных комплексов. В противоположность этому, зрелые ДК с высокой экспрессией HLA молекул могут быть наиболее подходящими для использования пептидов. Короткие пептиды (от 8 до 10 аминокислотных остатков) могут напрямую связываться с HLA молекулами (молекулами главного комплекса гистосовместимости) на поверхности ДК и не нуждаются в захвате антигена и его процессинге. В клинических исследованиях оцениваются молекулярно-биологические методы, которые способствуют увеличению функциональной активности ДК. Генные манипуляции с ДК ex vivo способствуют экспрессии на их поверхности молекул цитокинов или иммуностимулирующих молекул, которые могут усилить ДКТ-клеточное взаимодействие и, как следствие, противоопухолевый иммунный ответ (Philip R. et al., 1998).

Производится также поиск оптимальной дозы ДК, разрабатывается график вакцинаций, оцениваются пути введения ДК-вакцины. Установлено, что ДК должны обладать следующими свойствами:

1) после культивирования ex vivo быть жизнеспособными in vivo в течение продолжительного времени, так как они могут достаточно долго не встретить уникальные (редко встречающиеся) антигенспецифические Т-клетки в лимфатических узлах;
2) эффективно мигрировать к лимфатическим узлам;
3) содействовать эффекторной функции Т-клеток in vivo.
Кроме того, выживаемость in vivo эффекторных Т-клеток, генерированных с помощью вакцинации, нуждается в продолжительной стимуляции, обеспечивая тем самым оптимальную и устойчивую ориентацию на опухоль.

Важным является клинически оценить подкожное, внутрикожное, внутрилимфатическое и внутривенное введение ДК-вакцин. Введение вакцины в периферические лимфатические узлы требует от нагруженных ДК миграции в лимфоидную ткань и длительного поддержания там стимулирующей способности Т-клеток. При внутривенном введении ДК оседают в легких, печени, селезенке и костном мозге, но они не обнаруживаются в лимфатических узлах или опухолевых образованиях (Morse M. et al., 1999). В противоположность этому, исследования с использованием внутрикожного введения ДК, полученных из моноцитов, показали миграцию ДК в лимфатические узлы. В этих исследованиях использовались незрелые ДК, и их количество было незначительным. Большинство ДК остаются в месте введения (Thomas R. et al., 1999). Это свидетельствует о том, что незрелые ДК являются субоптимальной популяцией для достижения вакциной лимфоидной ткани. Вместе с тем Schuler-Thurner B. et al. (2000) использовали ДК, полученные из моноцитов ex vivo, которые эффективно стимулировали противоопухолевый иммунный ответ. Без прямого сравнения эти данные можно объяснить эффективной миграцией и представлением опухолеспецифического антигена Т-лимфоцитам активированными ex vivo ДК.

Перспективным является применение ДК-вакцин с гемопоэтическими факторами, провоспалительными средствами, Т-клеточными или другими цитокинами (Flt-3 лиганд, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, CD40 лиганд, интерлейкин-2, -12, интерфероны ?, ? и др.). Эти рекомбинантные клеточные факторы могут быть использованы как адъюванты при проведении ДК-вакцинотерапии (Pulendran B. et al., 1998; Williamson E. et al., 1999; Nestle F. et al., 2001).

Таким образом, представленный обзор данных литературы показывает, что методы вакцинотерапии на основе ДК при лечении онкологических больных могут быть самыми разнообразными. Разработке перспективных методов ДК-вакцинотерапии способствуют успехи, достигнутые в области молекулярной биологии, гибридомная технология, рекомбинантные формы различных биологически активных веществ и многие другие достижения.

Решение вопроса об эффективности противоопухолевых вакцин, применяемых с лечебной и адъювантной целями, будет основано на получении объективных данных об увеличении продолжительности жизни онкологических больных, отсутствии риска развития поствакцинальных осложнений и соотношении стоимость/эффективность.