Инфракрасный спектральный анализ сыворотки крови как отражение уровня нарушения метаболических процессов при инфекционной патологии у детей Часть 1

В.В.Краснов, А.С.Гордецов, Ю.Г.Кузмичев, А.А. Игнатьев, Е.Ф.Лукушкина, Н.В.Кулагина

Нижегородская Государственная медицинская академия, Детская инфекционная больница #8

URL

В основе спектроскопических методов лежит измерение зависимости интенсивности поглощения, испускания или рассеяния света веществом от частоты света (или длины волны). В оптической спектроскопии используются спектры поглощения в инфракрасной и ультрафиолетовой областях, а также спектры комбинационного рассеяния света и спектры люминесценции. Каждому спектру соответствует определенная область длин волн. В разных областях поглощение света имеет различную природу. При поглощении энергии в пределах оптического спектра может изменяться вращательная, колебательная энергия молекулы или энергия возбуждения внешних, валентных электронов. Для повышения вращательной энергии молекулы достаточны относительно небольшие энергии - соответствующее поглощение лежит в далекой инфракрасной (ИК) - области (области больших длин волн). Для увеличения колебательной энергии молекулы (для возбуждения колебаний атомов относительно друг друга) требуются кванты большой величины и поглощение лежит в близкой ИК-области. Еще большие кванты энергии требуются для возбуждения внешних электронов молекулы - поглощение в видимой и УФ-области.

Метод спектроскопического анализа позволяет определить количество того или иного вещества. Закон Бера - один из основополагающих законов спектроскопии, гласит: "Поглощение света пропорционально числу молекул поглощающего вещества на его пути".

В ИК-спектре различают четыре области: 1. видимая, 2. близкая, 3. фундаментальная и 4. далекая. Для исследования органических веществ наибольшее значение имеет фундаментальная инфракрасная область, лежащая в диапазоне от 5000 до 200 см^-1. Линии в области 600-1300 см^-1 отличны и специфичны даже для родственных молекул, поэтому ее называют областью "отпечатков пальцев" молекулы. В эту область попадают валентные колебания одинарных связей С-О, С-N, N-О. Напротив, частоты поглощения двойных связей С=С, С=О, N=О характеристичны, т.е. мало отличаются для разных молекул и лежат в области 1500-1950 см^-1. Поглощение тройных связей находится в еще более коротковолновой области (для С=С при 2100-2250 см^-1). ИК-спектр является абсолютно специфическим свойством каждого химического соединения, поэтому даже изомеры положения, геометрические изомеры и молекулы, содержащие протоны, обладают различными спектрами. В связи с этим ИК-спектр каждого вещества имеет отчетливую индивидуальность (fingerprint).

ИК-спектры применяются для идентификации соединений и установления степени их чистоты (качественно), а также они могут быть использованы для качественного анализа смесей при контроле над ходом реакции. Однако наиболее распространенное и важное применение ИК-спектров это выяснение и подтверждение предполагаемого строения соединений. Наличие почти любой функциональной группы в молекуле можно установить с их помощью. Кроме того, уже упоминалось о возможности проведения методом ИК-спектроскопии и количественного анализа.

Современные приборы "записывают" спектр автоматически, а ИК-спектрофотометры "Specord 80/85 IR" обеспечивают фотометрическую точность ±0,2%. Контрольная программа встроенного компьютера не допускает неправильных и несовместимых параметров, обеспечивает графикопостроение и линейную корреляцию базисной линии между 10 волновыми числами. Перечисленные факторы обеспечивают объективность и высокую точность спектроскопических анализов. Согласно современным представлениям основу клеточной мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, обусловливающий присущие мембране свойства жидкого кристалла. Нарушения структуры и функции клеточных мембран на всех этапах болезни являются главным выражением патологии при состояниях, сопровождающихся токсикозом. Роль патологии клеточных мембран и метаболизма, как составных звеньев токсикоза, отражается в большом количестве работ. Как известно генерализованные расстройства микроциркуляции, присущие патогенезу заболеваний, протекающих с токсикозом, являются причиной гипоксии. Нарастающая тканевая гипоксия приводит к изменению межклеточного вещества и клеточных мембран. В свою очередь, в механизмах развития патологии мембран ведущее место отводится гипоксическим нарушениям метаболизма клеток. В результате чрезмерное накопление кининов, биогенных аминов, протеаз и липаз, лизосомальных гидролаз, продуктов перекисного окисления липидов, свободных жирных кислот, а также патологических миокардио-депрессивных веществ формирует циркуляторную недостаточность. Чрезмерное накопление перечисленных агентов определяет синдром токсемии и вызывает повреждение практически всех функций и систем, включая сократимость миокарда, тонус сосудов, реологические свойства крови и т.д. В конечном итоге тканевая гипоксия нарушает пути биологического окисления. Страдают цикл Кребса и окисление глюкозы в системе пентозного шунта. Основным путём получения энергии становится анаэробный гликолиз с образованием молочной кислоты как конечного продукта. Лактатацидоз, стимулируя накопление НАДН, тормозит ферменты гликолиза (фосфорилаза, фосфофруктокиназа) и снижает активность этого пути окисления, возникает тяжёлый энергодефицит с истощением запасов макроэргов.

Одним из следствий дефицита энергии является накопление ионов и молекулярных частиц (ОН^-, Н+, НОО+ и др.), которые приводят к окислительному повреждению полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов мембран [1, 2, 3 ]. Перекиси липидов, в свою очередь, оказывают своё разрушительное действие и на основные макроэргические соединения АТФ, подвергающегося усиленному распаду до АДФ, АМФ и аденозина.

Существующий уровень знаний в области спектроскопии позволяет определять появление новых ("патологических") и исчезновение "нормальных" химических веществ (АТФ, ГТФ, УТФ и др.), которые при различных патологических состояниях подвергаются быстрому метаболизму, с образованием соответствующих продуктов гидролиза - монофосфатов. Также возможно определение концентрации белковых молекул и фосфатидов в процессе распада клеточных структур. В исследуемую зону ИК-спектра попадают и валентные связи свободных радикалов.

Таким образом ИК-спектроскопия позволяет определить уровень ряда метаболитов, образующихся в процессе патологических изменений, инициированных токсикозом и, соответственно оценить степень нарушения метаболических процессов.

На наш взгляд наиболее важным является не определение количества того или иного вещества (учитывая огромное их количество), находящегося в крови больного ребёнка, а корреляция интегративных показателей ИК-спектроскопического анализа со степенью выраженности токсикоза и, следовательно, уровнем метаболических нарушений. В процессе исследования под наблюдением находилось 183 ребёнка в возрасте от 1 года до 14 лет с различной инфекционной патологией. У 113 детей диагностирована токсическая дифтерия ротоглотки (ТДР), у 14 - локализованная дифтерия ротоглотки (ЛДР), у 44 детей выставлен диагноз - ангина (фолликулярная или лакунарная) и у 12 - инфекционный мононуклеоз (ИМН). Кроме того, для сравнения была взята группа здоровых детей, состоящая из 30-ти человек. По возрастному и половому составу данные группы детей соответствовали друг другу.

В качестве субстрата для исследования использовали сыворотку крови больных (здоровых) детей, приготовленную для проведения спектрального анализа. Сыворотку высушивали при комнатной температуре на полуприкрытой чашке Петри. Сухой остаток вводили в вазелиновое масло и получали суспензию, которую затем подвергали ИК - спектроскопии с регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см^-1. При получении спектрограммы определяли высоту пиков полос поглощения с максимумами при 1170, 1165, 1150, 1140, 1130, 1100, 1070, 1025 см^-1 и вычисляли среднее значение высоты всех пиков - С. Затем определяли отношение каждого предыдущего пика к последующему: 1170/1165, 1165/1150, 1150/1140, 1140/1130, 1130/1100, 1100/1070, 1070/1025. Информативные показатели обозначали условными символами (M, m, D, c, R, x, S). Показатель М представляет собой наибольшее полученное частное, а показатель м - наименьшее. Кроме того был введён дополнительный показатель - D, являющийся разностью М и м. Среднее значение всех частных обозначено, как показатель - с. Также вычисляли величину R - отношение высоты пика с максимумом при 1165 см^-1 к высоте пика с максимумом при 1170 см^-1, величину x - отношение высоты пика с максимумом при 1130 см^-1 к среднему значению величины высот пиков (С) и величину S - отношение высоты пика с максимумом при 1100 см^-1 к среднему значению величины высот (С).

Первоначально было проведено сравнение показателей ИК-спектроскопического анализа сыворотки крови здоровых детей и детей с различной инфекционной патологией, протекающей с синдромом ангины (табл. 1). Если рассматривать приведённые нозологические формы применительно к степени выраженности интоксикации, то следует согласиться, что наименее выраженный токсический синдром должен наблюдаться при ЛДР. Далее, по мере возрастания уровня интоксикации, заболевания расположатся в следующем порядке: ИМН, ангины и ТДР. На наш взгляд, такая градация обусловлена клинико-патогенетическими сведениями о каждом из заболеваний. Конечно, у отдельно взятого больного с ИМН уровень интоксикации может быть более выраженным, чем у конкретного больного ангиной, но на группе больных степень выраженности всех симптомов и синдромов усредняется. Соответственно у здоровых детей синдром интоксикации отсутствует. Известно, что нарушение метаболических процессов в организме нарастает по мере углубления токсикоза и эти две переменные величины имеют чёткую положительную корреляционную взаимосвязь.

Таблица 1. Показатели ИК-спектроскопии здоровых детей и при различных инфекционных заболеваниях, протекающих с синдромом ангины.

Нозологическая форма (здоровые)	Показатели ИК-спектроскопии
	M	м	c	D
1. здоровые дети	1,8±0,074	0,5±0,019	±	1,4±0,086
2. локализованная дифтерия	1,6±0,196	0,3±0,046	1,0±0,099	1,3±0,24
3. инфекционный мононуклеоз	1,9±0,333	0,3±0,066	1,0±0,066	1,6±0,394
4. ангины	1,3±0,052	0,5±0,020	0,9±0,026	0,8±0,064
5. токсическая дифтерия	1,4±0,053	0,5±0,017	0,9±0,023	0,9±0,064
	S	R	x
1. здоровые дети	0,6±0,015	0,6±0,023	0,7±0,019
2. локализованная дифтерия	0,8±0,086	0,3±0,071	0,8±0,044
3. инфекционный мононуклеоз	0,8±0,068	0,4±0,081	0,8±0,069
4. ангины	1,1±0,052	0,6±0,045	0,9±0,044
5. токсическая дифтерия	1,1±0,026	0,6±0,029	0,9±0,022

При рассмотрении таблицы прослеживается тенденция постепенного снижения числовых значений показателя M по мере возникновения и нарастания токсикоза (от здоровых детей к ТДР). Обратная (увеличение числового значения параметра), более чётко выраженная тенденция, отмечается у показателей S и x. Предположительно названные параметры - S, x и, в меньшей степени M, отражают уровень изменения метаболических процессов, находящийся во взаимосвязи со степенью интоксикации.

Кроме того, табл. 1 показывает, что при ТДР и ангинах, показатели ИК-спектроскопии имеют сходные значения, аналогичная ситуация имеет место при ЛДР и ИМН, а именно в таком порядке заболевания более сопоставимы по степени выраженности интоксикации.

С целью выяснения нормальных значений ИК-спектроскопических параметров, определили их диапазон у здоровых детей. Для этого выбрали минимальное и максимальное значение каждого из показателей (табл. 2).

Таблица 2. Наименьшее и наибольшее числовые значения параметров ИК - спектроскопии у здоровых детей.

Значение	Показатель ИК- спектроскопии
	D	M	m	R	S	x
min	0,55	1,23	0,30	0,43	0,50	0,45
max	2,50	2,88	0,70	0,88	0,80	0,86

Затем определили количество детей (в %) при каждой нозологической форме, у которых числовые значения параметров выходят за пределы принятой нормы (для каждого из параметров). Данные представлены на таблице 3. Следует отметить, что если числовые значения ИК-спектроскопических параметров ребёнка будут выходить за приведённые в таблице 2, мы можем с уверенностью отнести его к группе больных, т.к. у здоровых такие числовые значения не зафиксированы.

Таблица 3. Число детей (в %), имеющих отклонение от нормальных значений показателей ИК-спектроскопии, при инфекционных заболеваниях, протекающих с синдромом ангины.

Нозологическая форма	Показатель ИК-спектроскопии
	D<0.55	M<1,23	m<0,30	R<0,43	S<0,50	x<0,45
с-м ангины (все больные)		40,5	23,7	28,4	4,2	6,7
ЛДР		28,6	57,1	64,3	14,3	0,0
ИМН		33,3	58,3	58,3	8,3	8,3
ангина		45,5	9,1	22,7	6,8	11,5
ТДР	30,8	40,8	21,7	23,3	1,7	3,3
Нозологическая форма	Показатель ИК-спектроскопии
	D>2,50	M>2,88	m>0,70	R>0,88	S>0,80	x>0,86
с-м ангины (все больные)		2,6	4.7	10,0	69,5	68,9
ЛДР		7,1	0,0	7,1	50,0	35,7
ИМН		25,0	0,0	0,0	50,0	41,7
ангины		0,0	4,5	18,2	79,5	59,1
ТДР	0,8	0,8	5,8	8,3	80,8	68,3

Примечание: в первой графе (все больные) основную массу составляют дети с ТДР и ангинами.

Как видно из таблицы, показатели D, M, m и R при возникновении инфекционного заболевания имеют тенденцию к снижению (преимущественно у больных располагаются ниже min), в сравнении со здоровыми детьми, а S и x, наоборот преимущественно повышаются по отношению к норме (преимущественно выше max). Как уже отмечалось выше, тенденции поведения ИК-параметров сходны при ТДР и ангине, с одной стороны и при ЛДР и инфекционном мононуклеозе, с другой. Находит подтверждение и другая замеченная тенденция - увеличение количества больных с повышенными, по отношению к здоровым детям, числовыми значениями параметров S и х, по мере увеличения уровня интоксикации (р<0.05-0.01). Имеется и некоторая тенденция увеличения количества больных с пониженным значением показателя M, с 28.6% при ЛДР до 40.8-45.5% при ТДР и ангинах. Выявленная взаимосвязь изменений числовых значений параметров ИК-спектроскопии и выраженности интоксикации, присущей тому или иному инфекционному заболеванию, позволяет сделать вывод, что данный анализ является интегральным показателем, отражающим уровень нарушения метаболизма. Однако, безусловно, необходимо более подробно рассмотреть поведение параметров ИК-спектроскопии при ТДР. В таблице 4 приведены числовые значения параметров ИК-спектроскопии при различных клинических вариантах ТДР. Как видно из таблицы, сами числовые значения мало отличаются при разной степени ТДР. Данный факт можно объяснить тем, что степень ТДР выставляется на основании формального признака - выраженности ОПКШ и не всегда соответствует истинной тяжести патологического процесса. В связи с этим целесообразно рассмотреть числовые значения показателей в зависимости от исхода ТДР (табл.5).

Таблица 4. Показатели ИК-спектроскопии при различных формах токсической дифтерии у детей

Клинический вариант ТДР	показатели ИК-спектроскопии
	М	м	с	D
1.субтоксическая	1,3±0,063	0,5±0,028	0,9±0,035
2.токсическая 1ст.	1,5±0,114	0,5±0,034	0,9±0,037
3.токсическая 2ст.	1,4±0,182	0,6±0,026	0,9±0,078
4.токсическая 3ст.	1,4±0,060	0,4±0,036	0,9±0,031
	S	R	x
1.субтоксическая	1,2±0,041	0,7±0,062	1,0±0,039
2.токсическая 1ст	1,1±0,061	0,7±0,059	1,0±0,039
3.токсическая 2ст	1,2±0,047	0,6±0,043	1,0±0,033
4.токсическая 3ст	1,0±0,053	0,5±0,050	0,8±0,050

Таблица 5. показатели ИК-спектроскопии в зависимости от исхода токсической дифтерии у детей (М±м).

Исход ТДР	показатели ИК-спектроскопии
	М	м	с	D
выжившие	1,33±0,06	0,52±0,02	0,85±0,03
умершие	1,72±0,04	0,23±0,03	1,06±0,03
р	<0,001	<0,001	<0,001
	S	R	x
выжившие	1,15±0,03	0,65±0,03	0,98±0,02
умершие	0,91±0,07	0,34±0,07	0,72±0,08
р	<0,001	<0,001	<0,001

В этом случае, как показывет таблица, определяется достоверное различие числовых значений параметров ИК-спектроскопии у выживших и умерших детей.

Корреляционный анализ выявил, что если показатель - с по мере ухудшения прогноза растёт, то показатели - м и х снижаются при возможности летального исхода. Тенденцию показателя с в несколько меньшей корреляционной зависимости повторяет максимальное значение (М). Уровень корреляции этих показателей достоверен (р<0,05-0,001). Показатели S и R повторяют тенденцию минимального значения (м) и х. Таким образом, при ТДР сохраняется та же закономерность корреляционных взаимосвязей, которая определяется при ЛДР, ИМН и ангинах. В данном случае - корреляция параметров ИК-спектроскопии с исходом болезни - также рассматривается их поведение по мере нарастания степени токсикоза, но уже внутри группы больных с ТДР.

Таким образом, изменение числовых значений параметров ИК-спектроскопии при ТДР, подтверждает вывод, что они отражают степень выраженности токсикоза, а следовательно уровень нарушения метаболических процессов. Исходя из вышеизложенного следует предположить, что ИК-спектры сыворотки крови отражают уровень, метаболических нарушений в организме, возникающих под воздействием инфекционного агента. По понятным причинам эти изменения не являются специфическими для какого-либо отдельного заболевания, а отражают общие закономерности патогенеза инфекционного процесса.


Литература

1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. //М.-Наука.-1972.- С. 179.
2. Меерсон Ф.З. и др. Роль ПОЛ в патогенезе ишемического повреждения и антиоксидантная защита сердца.// Кардиология.-N.2.-1982.-С.81-92.
3. Папаян А.В., Цыбулькин Э.К. Острые токсикозы в раннем детском возрасте. // -Л.: Медицина, -1984. -232 с.