Инфракрасный спектральный анализ сыворотки крови как отражение уровня нарушения метаболических процессов при инфекционной патологии у детей.

В.В.Краснов, А.С.Гордецов, А.А. Игнатьев, Ю.Г.Кузмичев, Н.В.Кулагина, Е.Ф.Лукушкина.

Нижегородская Государственная медицинская академия, Детская инфекционная больница #8

URL

В основе спектроскопических методов лежит измерение зависимости интенсивности поглощения, испускания или рассеяния света веществом от частоты света (или длины волны). В оптической спектроскопии используются спектры поглощения в инфракрасной и ультрафиолетовой областях, а также спектры комбинационного рассеяния света и спектры люминесценции. Каждому спектру соответствует определенная область длин волн. В разных областях поглощение света имеет различную природу. При поглощении энергии в пределах оптического спектра может изменяться вращательная, колебательная энергия молекулы или энергия возбуждения внешних, валентных электронов. Для повышения вращательной энергии молекулы достаточны относительно небольшие энергии - соответствующее поглощение лежит в далекой инфракрасной (ИК) - области (области больших длин волн). Для увеличения колебательной энергии молекулы (для возбуждения колебаний атомов относительно друг друга) требуются кванты большой величины и поглощение лежит в близкой ИК-области. Еще большие кванты энергии требуются для возбуждения внешних электронов молекулы - поглощение в видимой и УФ-области.

Метод спектроскопического анализа позволяет определить количество того или иного вещества. Закон Бера - один из основополагающих законов спектроскопии, гласит: "Поглощение света пропорционально числу молекул поглощающего вещества на его пути".

В ИК-спектре различают четыре области: 1. видимая, 2. близкая, 3. фундаментальная и 4. далекая. Для исследования органических веществ наибольшее значение имеет фундаментальная инфракрасная область, лежащая в диапазоне от 5000 до 200 см-1. Линии в области 600-1300 см-1 отличны и специфичны даже для родственных молекул, поэтому ее называют областью "отпечатков пальцев" молекулы. В эту область попадают валентные колебания одинарных связей С-О, С-N, N-О. Напротив, частоты поглощения двойных связей С=С, С=О, N=О характеристичны, т.е. мало отличаются для разных молекул и лежат в области 1500-1950 см-1. Поглощение тройных связей находится в еще более коротковолновой области (для С=С при 2100-2250 см-1). ИК-спектр является абсолютно специфическим свойством каждого химического соединения, поэтому даже изомеры положения, геометрические изомеры и молекулы, содержащие протоны, обладают различными спектрами. В связи с этим ИК-спектр каждого вещества имеет отчетливую индивидуальность (fingerprint).

ИК-спектры применяются для идентификации соединений и установления степени их чистоты (качественно), а также они могут быть использованы для качественного анализа смесей при контроле над ходом реакции. Однако наиболее распространенное и важное применение ИК-спектров это выяснение и подтверждение предполагаемого строения соединений. Наличие почти любой функциональной группы в молекуле можно установить с их помощью. Кроме того, уже упоминалось о возможности проведения методом ИК-спектроскопии и количественного анализа.

Современные приборы "записывают" спектр автоматически, а ИК-спектрофотометры "Specord 80/85 IR" обеспечивают фотометрическую точность ±0,2%. Контрольная программа встроенного компьютера не допускает неправильных и несовместимых параметров, обеспечивает графикопостроение и линейную корреляцию базисной линии между 10 волновыми числами. Перечисленные факторы обеспечивают объективность и высокую точность спектроскопических анализов. Согласно современным представлениям основу клеточной мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, обусловливающий присущие мембране свойства жидкого кристалла. Нарушения структуры и функции клеточных мембран на всех этапах болезни являются главным выражением патологии при состояниях, сопровождающихся токсикозом. Роль патологии клеточных мембран и метаболизма, как составных звеньев токсикоза, отражается в большом количестве работ. Как известно генерализованные расстройства микроциркуляции, присущие патогенезу заболеваний, протекающих с токсикозом, являются причиной гипоксии. Нарастающая тканевая гипоксия приводит к изменению межклеточного вещества и клеточных мембран. В свою очередь, в механизмах развития патологии мембран ведущее место отводится гипоксическим нарушениям метаболизма клеток. В результате чрезмерное накопление кининов, биогенных аминов, протеаз и липаз, лизосомальных гидролаз, продуктов перекисного окисления липидов, свободных жирных кислот, а также патологических миокардио-депрессивных веществ формирует циркуляторную недостаточность. Чрезмерное накопление перечисленных агентов определяет синдром токсемии и вызывает повреждение практически всех функций и систем, включая сократимость миокарда, тонус сосудов, реологические свойства крови и т.д. В конечном итоге тканевая гипоксия нарушает пути биологического окисления. Страдают цикл Кребса и окисление глюкозы в системе пентозного шунта. Основным путём получения энергии становится анаэробный гликолиз с образованием молочной кислоты как конечного продукта. Лактатацидоз, стимулируя накопление НАДН, тормозит ферменты гликолиза (фосфорилаза, фосфофруктокиназа) и снижает активность этого пути окисления, возникает тяжёлый энергодефицит с истощением запасов макроэргов.

Одним из следствий дефицита энергии является накопление ионов и молекулярных частиц (ОН-, Н+, НОО+ и др.), которые приводят к окислительному повреждению полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов мембран [1, 2, 3 ]. Перекиси липидов, в свою очередь, оказывают своё разрушительное действие и на основные макроэргические соединения АТФ, подвергающегося усиленному распаду до АДФ, АМФ и аденозина.

Существующий уровень знаний в области спектроскопии позволяет определять появление новых ("патологических") и исчезновение "нормальных" химических веществ (АТФ, ГТФ, УТФ и др.), которые при различных патологических состояниях подвергаются быстрому метаболизму, с образованием соответствующих продуктов гидролиза - монофосфатов. Также возможно определение концентрации белковых молекул и фосфатидов в процессе распада клеточных структур. В исследуемую зону ИК-спектра попадают и валентные связи свободных радикалов.

Таким образом ИК-спектроскопия позволяет определить уровень ряда метаболитов, образующихся в процессе патологических изменений, инициированных токсикозом и, соответственно оценить степень нарушения метаболических процессов.

На наш взгляд наиболее важным является не определение количества того или иного вещества (учитывая огромное их количество), находящегося в крови больного ребёнка, а корреляция интегративных показателей ИК-спектроскопического анализа со степенью выраженности токсикоза и, следовательно, уровнем метаболических нарушений. В процессе исследования под наблюдением находилось 183 ребёнка в возрасте от 1 года до 14 лет с различной инфекционной патологией. У 113 детей диагностирована токсическая дифтерия ротоглотки (ТДР), у 14 - локализованная дифтерия ротоглотки (ЛДР), у 44 детей выставлен диагноз - ангина (фолликулярная или лакунарная) и у 12 - инфекционный мононуклеоз (ИМН). Кроме того, для сравнения была взята группа здоровых детей, состоящая из 30-ти человек. По возрастному и половому составу данные группы детей соответствовали друг другу.

В качестве субстрата для исследования использовали сыворотку крови больных (здоровых) детей, приготовленную для проведения спектрального анализа. Сыворотку высушивали при комнатной температуре на полуприкрытой чашке Петри. Сухой остаток вводили в вазелиновое масло и получали суспензию, которую затем подвергали ИК - спектроскопии с регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см-1. При получении спектрограммы определяли высоту пиков полос поглощения с максимумами при 1170, 1165, 1150, 1140, 1130, 1100, 1070, 1025 см-1 и вычисляли среднее значение высоты всех пиков - С. Затем определяли отношение каждого предыдущего пика к последующему: 1170/1165, 1165/1150, 1150/1140, 1140/1130, 1130/1100, 1100/1070, 1070/1025. Информативные показатели обозначали условными символами (M, m, D, c, R, x, S). Показатель М представляет собой наибольшее полученное частное, а показатель м - наименьшее. Кроме того был введён дополнительный показатель - D, являющийся разностью М и м. Среднее значение всех частных обозначено, как показатель - с. Также вычисляли величину R - отношение высоты пика с максимумом при 1165 см-1 к высоте пика с максимумом при 1170 см-1, величину x - отношение высоты пика с максимумом при 1130 см-1 к среднему значению величины высот пиков (С) и величину S - отношение высоты пика с максимумом при 1100 см-1 к среднему значению величины высот (С).

Первоначально было проведено сравнение показателей ИК-спектроскопического анализа сыворотки крови здоровых детей и детей с различной инфекционной патологией, протекающей с синдромом ангины (табл. 1). Если рассматривать приведённые нозологические формы применительно к степени выраженности интоксикации, то следует согласиться, что наименее выраженный токсический синдром должен наблюдаться при ЛДР. Далее, по мере возрастания уровня интоксикации, заболевания расположатся в следующем порядке: ИМН, ангины и ТДР. На наш взгляд, такая градация обусловлена клинико-патогенетическими сведениями о каждом из заболеваний. Конечно, у отдельно взятого больного с ИМН уровень интоксикации может быть более выраженным, чем у конкретного больного ангиной, но на группе больных степень выраженности всех симптомов и синдромов усредняется. Соответственно у здоровых детей синдром интоксикации отсутствует. Известно, что нарушение метаболических процессов в организме нарастает по мере углубления токсикоза и эти две переменные величины имеют чёткую положительную корреляционную взаимосвязь.

Таблица 1. Показатели ИК-спектроскопии здоровых детей и при различных инфекционных заболеваниях, протекающих с синдромом ангины.

Нозологическая форма (здоровые)	Показатели ИК-спектроскопии
	M	Н	c	D
1. здоровые дети	1,8±0,074	0,5±0,019	±	1,4±0,086
2. локализованная дифтерия	1,6±0,196	0,3±0,046	1,0±0,099	1,3±0,24
3. инфекционный мононуклеоз	1,9±0,333	0,3±0,066	1,0±0,066	1,6±0,394
4. ангины	1,3±0,052	0,5±0,020	0,9±0,026	0,8±0,064
5. токсическая дифтерия	1,4±0,053	0,5±0,017	0,9±0,023	0,9±0,064
	S	R	x
1. здоровые дети	0,6±0,015	0,6±0,023	0,7±0,019
2. локализованная дифтерия	0,8±0,086	0,3±0,071	0,8±0,044
3. инфекционный мононуклеоз	0,8±0,068	0,4±0,081	0,8±0,069
4. ангины	1,1±0,052	0,6±0,045	0,9±0,044
5. токсическая дифтерия	1,1±0,026	0,6±0,029	0,9±0,022

При рассмотрении таблицы прослеживается тенденция постепенного снижения числовых значений показателя M по мере возникновения и нарастания токсикоза (от здоровых детей к ТДР). Обратная (увеличение числового значения параметра), более чётко выраженная тенденция, отмечается у показателей S и x. Предположительно названные параметры - S, x и, в меньшей степени M, отражают уровень изменения метаболических процессов, находящийся во взаимосвязи со степенью интоксикации.

Кроме того, табл. 1 показывает, что при ТДР и ангинах, показатели ИК-спектроскопии имеют сходные значения, аналогичная ситуация имеет место при ЛДР и ИМН, а именно в таком порядке заболевания более сопоставимы по степени выраженности интоксикации.

С целью выяснения нормальных значений ИК-спектроскопических параметров, определили их диапазон у здоровых детей. Для этого выбрали минимальное и максимальное значение каждого из показателей (табл. 2).

Таблица 2. Наименьшее и наибольшее числовые значения параметров ИК - спектроскопии у здоровых детей.

 

Значение	Показатель ИК- спектроскопии
	D	M	m	R	S	x
min	0,55	1,23	0,30	0,43	0,50	0,45
max	2,50	2,88	0,70	0,88	0,80	0,86