Фармакология - Экспресс-метод отбора предпочтительных антибиотиков для лечения больных гнойно-септическими инфекциями
М.И. Леви, Ю.П. Сучков, В.Г. Слизкова
Испытательный лабораторный центр МГЦД
Предложен экспресс-метод отбора предпочтительных антибиотиков в ходе исследования гнойных выделений и перевязочных материалов ран, основанный на способности антибиотиков предотвращать изменение цвета питательной среды, возникающего при росте бактерий.
Метод апробирован на больных с гнойными осложнениями и позволил представить расчетные данные для определения вводимых доз антибиотика, способных создать его избыток в гнойных секрециях.
Express-method of choice of the preferable antibiotics of purulent septic infections treatment
M.I. Levi, Ju.G. Suchkov, V.G. Sliskova
Research
laboratory center of Moscow city disinfection center
Express method of choice of the preferable antibiotics is offered during research of purulent discharges and dressing materials of wounds based on ability of antibiotics to prevent nutrition medium color change at bacteria grows.
The method was proved on ill men with purulent complications and allow to present prediction data for definition of antibiotics inlet doses capable to create antibiotic excess in the purulent secretions.
Проблема выбора предпочтительных антибиотиков для лечения инфекционных больных приобрела выдающееся значение на фоне широко распространенной резистентности возбудителей заболеваний [7]. Наряду с хорошо известным диско-диффузионным методом появились предложения использовать метод серийных разведений антибиотиков, в особенности при применении цветной питательной среды, учитывающий изменения рН в процессе жизнедеятельности микробов [1, 2].
Настоящее исследование посвящено упрощению недавно предложенного ускоренного метода, ведущего к устранению некоторых недостатков упомянутого выше метода и сокращению времени, затрачиваемого на выполнение анализа [2, 8].
Материалы и методы
Для анализа использовали стерильные 96-луночные планшеты с плоским дном, предназначенные для иммуно-ферментного анализа. В луночки помещали серийные разведения антибиотиков на цветной питательной среде с шагом 4, начиная с концентрации 625 мкг/мл (последняя концентрация антибиотика 0,04 мкг/мл). В контрольные лунки помещали только цветную питательную среду. После высушивания при комнатной температуре содержимого луночек планшеты заключали в полиэтиленовый пакет, герметизировали его и хранили в прохладном затененном месте до использования. На одном планшете помещали разведения 11 антибиотиков: ампициллин, бензилпенициллин, стрептомицин, гентамицин, тетрациклин, линкомицин, клафоран (цефотаксим), рифампицин, цефазолин, цефалотин, цефат (цефамандол). Двенадцатая строка планшета, в луночках которой высушена питательная среда, оставлена для контроля активности исследуемого материала и исходного цвета жидкой питательной среды. Больные были госпитализированы в 67 городской клинической больнице г. Москвы (зав. отделением В.А. Терушкин), гнойное отделяемое отбирали во время перевязки ватным тампоном, смоченным цветной питательной средой. Помимо отделяемого из раны в нескольких случаях использовали экстракт (0,85% натрия хлорида) тех частей повязки, которые содержали отделяемое раны. Материал от больных доставляли в бактериологическую лабораторию, где, с помощью цветной питательной среды, готовили соответствующие разведения исследуемых материалов и по 0,05 мл добавляли во все луночки (кроме контроля цвета питательной среды) заранее заготовленных планшетов с высушенными разведениями антибиотиков. Во время манипуляций с гнойным отделяемым соблюдали меры предосторожности, предусмотренные в "Методических рекомендациях..." [5]. Планшеты слегка встряхивали и помещали в термостат при 37°С до того времени, когда в луночках, контролирующих активность исследуемого материала, исходный цвет питательной среды сменится на желтый. Время конверсии цвета в этих контрольных лунках зависело от концентрации жизнеспособных микробов в исследуемом материале (обычно 3-6 часов). После чего приступали к учету результатов анализа. Сохранение исходного цвета питательной среды свидетельствовало об эффективности данной концентрации антибиотика, а появление желтого цвета - о недостаточной его концентрации, не способной подавить активность бактерий.
Минимальную нейтрализующую концентрацию (МНК) определяли как концентрацию антибиотика (мкг в мл) в последней не пожелтевшей луночке.
В экспериментах в качестве микробных агентов использовали лабораторные культуры Escherichia Coli штамм К-12 и Staphilococcus aureus штамм Wood, которые выращивали на гидролизатном питательном агаре НИИ питательных сред (Махачкала, Россия). Цветную питательную среду, содержавшую 0,002% индикатора бромкрезолпурпур и 0,5% глюкозы, употребляли двух сортов, из которых один служил для приготовления растворов антибиотиков, а другой - для приготовления взвесей гнойного отделяемого из ран больных или взвесей бактериальных культур.
Объем добавленного в луночки материала определен в 0,05 мл, так как меньшие (0,002; 0,005; 0,01; 0,02 мл) и большие (0,1 мл) удлиняли время "проявления" активности в контрольных луночках.
Таблица 1 Активность антибиотиков в луночках планшета после 2-недельного встряхивания (200 качаний/мин)
| Исследованный планшет | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гентамицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | |
| после встряхивания | 625 | 156 | 40 | 10 | <0,04 | 625 | 2,5 | 10 | 10 | 40 | 2,5 |
| после хранения в холодильнике | 625 | 156 | 40 | 10 | <0,04 | 625 | 2,5 | 10 | 10 | 40 | 10 |
Сравнение времени "проявления" активности в контрольных луночках при экспресс-методе и в ускоренном методе, в котором используются растворы антибиотиков, не выявили существенных различий. Экономия времени в экспресс-методе достигается за счет устранения этапа приготовления и размещения в планшете разведений антибиотиков. Переход высущенных антибиотиков в раствор при добавлении 0,05 мл исследуемого материала в луночку происходит в короткие сроки. Результаты использования экспресс-метода, в котором антибиотики были заранее высушены в луночках планшета, совпадали с результатами ускоренного метода, в котором применяли растворы антибиотика.
К достоинствам экспресс-метода следует отнести относительно длительное хранения в надлежащих условиях планшетов с высушенными в луночках антибиотиками без потери их антибактериальной активности (срок наблюдения 6 месяцев), в то время как в ускоренном методе приходится заботиться о сохранении активности в остатках раствора антибиотиков.
Встряхивание планшетов с высушенными антибиотиками в течение 2 недель при комнатной температуре (с перерывом на ночное время и выходные дни) не привело к сколько-нибудь заметному слущиванию с поверхности луночек высушенных антибиотиков и потере антибактериальной активности, если сравнивать эти показатели с аналогичными для планшетов, хранившимися при 4°C (табл. 1).
Необходимо подчеркнуть хорошую воспроизводимость результатов экспресс-метода на разных планшетах, нередко использованных в разное время. Как правило, получали совпадающие результаты.
Мы применяли зарубежные планшеты фирмы (Linbro, США) и планшеты отечественного производства (Медполимер, Россия). Каких-либо существенных различий в активности разных антибиотиков не отмечено (табл. 2).
При исследовании гнойного отделяемого ран мы определяли МНК и относим антибиотики к эффективным "Ч" (микрофлора отделяемого раны оказалась чувствительной к конкретному антибиотику) или неэффективным "У" (микрофлора отделяемого раны оказалась устойчивой к конкретному антибиотику). Из 9 обследованных больных в одном случае среди 11 антибиотиков не оказалось ни одного эффективного. В пяти случаях неэффективные антибиотики составили больше половины из 11, в остальных случаях их было менее половины. При отнесении антибиотиков к эффективным или неэффективным использовали численные показатели МПК, приведенные в [7, 9].
Для отбора наиболее эффективных антибиотиков использовали значение величины МНК. Иногда отбирали не один, а два антибиотика, в особенности, если они принадлежали к разным группам.
Методика определения расчетных показателей основывалась на сочетании полученных при анализе значений МНК и литературных данных [3, 4, 7, 9]. В начале определяли по данным литературы две величины: вводимых доз антибиотиков и соответствующих им концентраций антибиотиков в сыворотке (обычно отмечают наивысшие концентрации). Разделив первую величину на вторую, получали некую вспомогательную величину, которую обозначали как "коэффициент распределения антибиотика в сыворотке". Этот коэффициент не является сколько-нибудь постоянным, так как клиренс антибиотика приводит к возрастанию коэффициента, но мы его использовали в качестве ориентировочного для расчетов. Далее предположили, что непосредственно в гнойном отделяемом концентрация антибиотика заметно ниже, чем в сыворотке, оценив эту разницу предположительно в 10 раз. В этом случае и коэффициент распределения антибиотика в гнойном отделяемом возрастет в 10 раз по сравнению с коэффициентом для сыворотки. Теперь для того, чтобы определить дозу антибиотика, которую следует ввести для получения МНК, зафиксированную в таблице 3, следует пойти обратным ходом и умножить эту МНК на полученный коэффициент распределения антибиотика для гнойного отделяемого. Это произведение отражает, по нашему предположению, ту дозу антибиотика, которую необходимо ввести для того, чтобы в гнойном отделяемом найти экспресс-методом МНК в указанной в таблице 3 концентрации. Для устойчивого благоприятного результата антибиотикотерапии необходимо создать весомый избыток в сыворотке антибиотика над значением МПК. Поэтому мы в таблице 3 приводим такую расчетную дозу вводимого антибиотика, которая могла существенно превышать в гнойном отделяемом значение МНК, для чего увеличиваем эту дозу в 10 раз, по сравнению с дозой, обеспечивающей достижение концентрации антибиотика, равной МНК. Еще следует учитывать поправку, связанную с разведением раневого отделяемого перед исследованием экспресс-методом, если степень разведения известна хотя бы приблизительно.
Таблица 2 Сопоставление активности антибиотиков, высушенных в луночках отечественных (Медполимер) и зарубежных (Linbro) планшетов
| Производство планшетов | Номер планшета | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гента мицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | ||
| Медполимер | 1 | >625 | 625 | 40 | 2,5 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 |
| 2 | >625 | 625 | 40 | 40 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 | |
| Linbros | 1 | >625 | 625 | 40 | 40 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 |
| 2 | >625 | >625 | 165 | 40 | <0,04 | >625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 | |
Таблица 3 Влияние антибиотиков на гнойное отделяемое больных с целью определения МНК*) экспресс-методом и установление расчетной дозы предпочитаемого антибиотика для достижения его избытка в отделяемом раны
| NN п/п | Фами лия боль ного | Диагноз | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | Наиболее эффективный антибиотик | Вве дение анти биоти ка | Коэф фициент расп реде ления анти биотика в сыво ротке | Рас чет ная суто чная доза для дос тиже ния МНК в очаге пора же ния (мг) | Рас четная суто чная доза для дос тиже ния избы тка анти био тика (10*МК) в очаге пора жения (мг) | Опти маль ная суто чная доза анти био тика (мг) | Мак сима льная суто чная доза анти био тика (мг) | ||||||||||
| Ампи цил лин | Бен зил пен ицил лин | Стре птом ицин | Гент ами цин | Тет раци клин | Лин коми цин | Кла фо ран | Риф ампи цин | Цеф азо лин | Цеф ало тин | Це фат | ||||||||||
| 1 | Г-в | Гнойная рана голени | 40 У | 0,6 Ч | 625 У | 2,5 УЧ | 0,6 Ч | 625 У | 0,6 Ч | <0,04 Ч | 0,6 Ч | 0,15 Ч | 0,6 Ч | Рифампицин Цефалотин | внутрь в/в | 100000 20000 | 40 30 | 400 300 | 900 2000 | 1200 8000 |
| 2 | К-ко | Гнойная рана после ампутации бедра | <0,04 Ч | 156 У | 156 У | 156 У | 0,6 Ч | 625 У | <0,04 Ч | 10 У | 10 Ч | 156 У | 2,5 Ч | Ампициллин Клафоран | в/в в/в | 200000 10000 | 80 4 | 800 40 | 3000 1000 | 14000 2000 |
| 3 | Дем-в | Гнойная рана после обморожения | 2,5 Ч | <0,04 Ч | 10 УЧ | 2,5 УЧ | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | Бензил пенициллин Тетра циклин | в/в внутрь | 700000 100000 | 300 40 | 3000 400 | 6000 1000 | 36000 2000 |
| 4 | З-в | Гнойная рана голени | >625 У | >625 У | >625 У | 625 У | 625 У | 625 У | 40 У | 156 У | 625 У | 625 У | 625 У | - | ||||||
| 5 | Ел-н | Гнойная рана стопы | 40 У | 2,5 У | 625 У | 625 У | 40 У | >625 У | 0,6 Ч | 2,5 УЧ | 40 У | 40 У | 10 УЧ | Клафоран | в/в | 10000 | 60 | 600 | 2000 | 12000 |
| 6 | Ар-ев | Нагноение после обморожения стопы | 156 У | 40 У | 156 У | >625 У | 156 У | 625 У | <0,04 Ч | 10 У | 40 У | 40 У | 2,5 Ч | Клафоран | в/в | 10000 | 4 | 40 | 2000 | 12000 |
| 7 | Кл-в | Гнойная рана после ампутации бедра | 625 У | 156 У | 625 У | 2,5 Ч | <0,04 Ч | >625 У | 2,5 Ч | 40 У | 10 Ч | 156 У | 2,5 Ч | Тетрациклин | внутрь | 100000 | 40 | 400 | 1000 | 2000 |
| 8 | Б-в | Послеопе рационная гнойная рана в паховой области | 625 У | 40 У | 156 У | 2,5 УЧ | 0,15 Ч | 156 У | <0,04 Ч | 2,5 УЧ | 10 Ч | 40 У | 0,6 Ч | Клафоран | в/в | 10000 | 4 | 40 | 2000 | 12000 |
| 9 | Во-в | Фурункул ягодицы | 40 У | 2,5 УЧ | 2,5 Ч | 0,15 Ч | 0,6 Ч | 0,6 Ч | 0,6 Ч | <0,04 Ч | 0,15 Ч | <0,04 Ч | 0,15 Ч | Цефалотин | в/в | 20000 | 30 | 300 | 2000 | 8000 |
Правая половина таблицы составлена на основании показателей, приведенных в литературе (объяснения изложены в тексте).
*) МНК - минимальная нейтрализующая концентрация.
Последние две графы в таблице 3 содержат сведения об оптимальной и максимально допустимой дозами антибиотиков, которые почерпнуты из современных литературных источников [3, 4, 9]. Они позволяют сопоставить расчетные значения вводимой дозы эффективных антибиотиков с оптимальными и предельными дозами. Во всех 9 случаях дозы, позволяющие создать избыток антибиотика в раневом отделяемом, ниже, чем те, которые считаются оптимальными. Если не использовать методы отбора эффективных антибиотиков, а применять антибиотики, рекомендованные до определения возбудителя и его чувствительности [9], то нередко создать избыточную концентрацию рекомендуемого для конкретной болезни антибиотика вряд ли удастся (даже если МНК составляет 10 мкг/мл), так как она заметно превышает максимально допустимую дозу.
Оказалось, что для экспресс-метода можно использовать не только гнойное отделяемое, но и экстракт повязок или салфетки, накладываемой на рану. В нескольких случаях мы параллельно использовали как гнойное отделяемое, так и экстракт участка перевязочного материала, и получали, как правило, совпадающие результаты. Один из таких протоколов приведен в таблице 4.
Обсуждение результатов
Ускоренный метод отбора эффективных антибиотиков [1, 5] предлагает применение растворов антибиотиков, что, с практической точки зрения, менее удобно, чем использование планшетов с заранее высушенными антибиотиками в экспресс-методе, когда бактериологу остается лишь внести в луночки планшета по 0,05 мл исследуемого материала, а затем следить за конверсией цвета в термостате. Сокращение времени анализа в экспресс-методе достигается за счет избавления от необходимости тратить время на приготовление разведений антибиотиков в луночках.
Преимущество экспресс-метода обеспечивает возможность сохранения планшетов с заранее высушенными антибиотиками, отсутствие каких-либо различий в антибактериальной активности у отечественных и американских планшетов, отсутствие влияния многочасового встряхивания готовых планшетов и высокая воспроизводимость результатов. Методика экспресс-метода столь неприхотлива, что может выполняться, после надлежащей подготовки, средним медицинским персоналом.
В настоящей работе использован новый термин - минимальная нейтрализующая концентрация - МНК, которая не совпадает с определением минимальной подавляющей концентрации - МПК. Эта последняя величина МПК определяется диско-диффузионным методом в относительно стандартных условиях (на агар наносится определенное число микробных клеток с последующим замером зоны задержки роста бактерий и переводом диаметра этой зоны в МПК). Что касается МНК, то мы исходим из того, что отделяемое раны обладает способностью в условиях термостата изменять исходный цвет питательной среды в желтый, а антибиотик нейтрализует этот эффект. При этом величина МНК в значительной степени зависит от вида (видов) микроорганизма в отделяемом и его концентрации. В конкретном случае регистрируется лишь цветовой эффект и его нейтрализация. Исследование посевов из луночек с неизменным цветом питательной среды показало, что в некоторых случаях обнаруживаются жизнеспособные бактерии, хотя и в небольшом числе, а в других случаях их там не обнаруживают. Относительно быстрое определение МНК позволяет оценивать активность разных антибиотиков в отношении микробной обсеменен-ности отделяемого раны обычно в день взятия материала на исследование, в то время как определение на МПК запаздывает на несколько суток, когда ситуация в ране может измениться.
Таблица 4 Сопоставление результатов определения активности антибиотиков при исследовании гнойного отделяемого и экстракта участка повязки на ране больного Б-ва.
| Исследованный материал | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гента мицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | |
| гнойное отделяемое | 625 | 40 | 156 | 2,5 | 0,15 | 156 | <0,04 | 2,5 | 10 | 40 | 0,6 |
| экстракт повязки на ране | 625 | 40 | 156 | 2,5 | 0,15 | 156 | <0,04 | 2,5 | 2,5 | 10 | 0,6 |
Расчетные значения вводимых в организм больного доз антибиотиков позволяют ориентироваться в отношении возможного избытка антибиотика в гнойном отделяемом. Эти расчеты базируются на некоторых, вероятно, не всегда корректных допущениях. Рассчитать градиент падения концентрации антибиотика от сыворотки к гнойному отделяемому не просто, во всяком случае, мы располагаем лишь предположениями на этот счет. Что касается избытка антибиотика в раневом отделяемом, то и здесь нет достоверных сведений, хотя мы не теряем надежду разработать соответствующую методику в недалеком будущем. В любом случае желательно обладать подобными сведениями для каждого конкретного больного, нуждающегося в антибиотикотерапии.
Существенным облегчением для определения МНК можно считать возможность анализа не только гнойного отделяемого, но и элементов перевязочных средств. В последнем случае можно было бы опасаться массивных количеств случайных бактерий, но использование стерилизованных перевязочных материалов, вероятно, отвергает эти опасения, как свидетельствует наш небольшой опыт. За относительно короткое время, затрачиваемое экспресс-методом, возможные незначительные количества посторонних бактерий не могут эффективно конкурировать с микробной флорой гнойного отделяемого из-за способности изменять цвет питательной среды.
Рациональная антибиотикотерапия складывается из быстрого выбора эффективных антибиотиков и вводимой дозы, способной создать избыток в очаге поражения, убежденности в том, что такой избыток достигнут, и определения длительности лечения с помощью антибиотиков. Желательно, чтобы эти рекомендации были выбраны исходя не из общих соображений, а конкретно для каждого больного. Первые три показателя должны быть получены в результате сочетанной работы клинициста, клинического бактериолога и клинического фармаколога, а длительность лечения - это, скорее, прерогатива лечащего врача, основывающегося на результатах первых дней применения этиотропного лечения.
Выводы
1. Применение планшетов с заранее высушенным в луночках антибиотиками сокращает время, затрачиваемое на отбор наиболее эффективных антибиотиков, и существенно упрощает сам анализ.
2. Экспресс-метод отбора эффективных антибиотиков был апробирован в анализе гнойного отделяемого и перевязочного материала ран нескольких больных. Расчетные данные, основанные на результатах исследования конкретных больных в сочетании со сведениями, почерпнутыми из литературных источников, позволили оценить возможные дозы антибиотиков, необходимые для сооздания их избытка в гнойном отделяемом.
Литература
1. Леви М.И, Горожанкина И.А., Сагатовская Л.А.
Быстрый метод определения чувствительности бактериальных
культур к различным антибиотикам в жидкой среде.
Антибиотики, 1967, N1, с. 57-62.
2. Леви М.И., Сучков
Ю.Г., Прохоров В.Я., Терушкин В.А. Ускоренный отбор
эффективных антибиотиков для лечения больных
госпитальными инфекциями. Дезинфекционное дело, 1999,
N3, с. 18-24.
3. Лекарственные препараты зарубежных
фирм в России. Справочник. М.,
"Астрафармсервис", 1993.
4. Машковский И.Д.
Лекарственные средства. Т.2, Изд. 13, М., 1998.
5.
Методические рекомендации по ускоренному отбору
эффективных антибиотиков для лечения больных
госпитальными инфекциями. Утверждены МЗ РФ 10.01.2000 г.
за N1100/26-0-117. Дезинфекционное дело 1999, N3,
Приложение.
6. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная
антибиотикотерапия. Изд. 4, М., 1982.
7. Сидоренко
С.В., Колупаев В.Е. Антибиотикограмма:
диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов.
Изд. группа "Арина", 1999.
8. Сидоренко
С.В., Федорович В.Ю. Ускоренный метод определения
минимальной подавляющей концентрации антибиотиков на
планшетных спектрофотометрах со встроенным термостатом.
В кн.: "Внутрибольничные инфекции - проблемы
эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и
профилактики", М., 1999, с. 220-221.
9. Сэнфорд
Дж., Гилберт Д., Гербердинг Дж., Сэнде М. Антимикробная
терапия. Изд. 23., М., 1996.
Экспресс-метод отбора предпочтительных антибиотиков для лечения больных гнойно-септическими инфекциями
М.И. Леви, Ю.П. Сучков, В.Г. Слизкова
Испытательный лабораторный центр МГЦД
Предложен экспресс-метод отбора предпочтительных антибиотиков в ходе исследования гнойных выделений и перевязочных материалов ран, основанный на способности антибиотиков предотвращать изменение цвета питательной среды, возникающего при росте бактерий.
Метод апробирован на больных с гнойными осложнениями и позволил представить расчетные данные для определения вводимых доз антибиотика, способных создать его избыток в гнойных секрециях.
Express-method of choice of the preferable antibiotics of purulent septic infections treatment
M.I. Levi, Ju.G. Suchkov, V.G. Sliskova
Research
laboratory center of Moscow city disinfection center
Express method of choice of the preferable antibiotics is offered during research of purulent discharges and dressing materials of wounds based on ability of antibiotics to prevent nutrition medium color change at bacteria grows.
The method was proved on ill men with purulent complications and allow to present prediction data for definition of antibiotics inlet doses capable to create antibiotic excess in the purulent secretions.
Проблема выбора предпочтительных антибиотиков для лечения инфекционных больных приобрела выдающееся значение на фоне широко распространенной резистентности возбудителей заболеваний [7]. Наряду с хорошо известным диско-диффузионным методом появились предложения использовать метод серийных разведений антибиотиков, в особенности при применении цветной питательной среды, учитывающий изменения рН в процессе жизнедеятельности микробов [1, 2].
Настоящее исследование посвящено упрощению недавно предложенного ускоренного метода, ведущего к устранению некоторых недостатков упомянутого выше метода и сокращению времени, затрачиваемого на выполнение анализа [2, 8].
Материалы и методы
Для анализа использовали стерильные 96-луночные планшеты с плоским дном, предназначенные для иммуно-ферментного анализа. В луночки помещали серийные разведения антибиотиков на цветной питательной среде с шагом 4, начиная с концентрации 625 мкг/мл (последняя концентрация антибиотика 0,04 мкг/мл). В контрольные лунки помещали только цветную питательную среду. После высушивания при комнатной температуре содержимого луночек планшеты заключали в полиэтиленовый пакет, герметизировали его и хранили в прохладном затененном месте до использования. На одном планшете помещали разведения 11 антибиотиков: ампициллин, бензилпенициллин, стрептомицин, гентамицин, тетрациклин, линкомицин, клафоран (цефотаксим), рифампицин, цефазолин, цефалотин, цефат (цефамандол). Двенадцатая строка планшета, в луночках которой высушена питательная среда, оставлена для контроля активности исследуемого материала и исходного цвета жидкой питательной среды. Больные были госпитализированы в 67 городской клинической больнице г. Москвы (зав. отделением В.А. Терушкин), гнойное отделяемое отбирали во время перевязки ватным тампоном, смоченным цветной питательной средой. Помимо отделяемого из раны в нескольких случаях использовали экстракт (0,85% натрия хлорида) тех частей повязки, которые содержали отделяемое раны. Материал от больных доставляли в бактериологическую лабораторию, где, с помощью цветной питательной среды, готовили соответствующие разведения исследуемых материалов и по 0,05 мл добавляли во все луночки (кроме контроля цвета питательной среды) заранее заготовленных планшетов с высушенными разведениями антибиотиков. Во время манипуляций с гнойным отделяемым соблюдали меры предосторожности, предусмотренные в "Методических рекомендациях..." [5]. Планшеты слегка встряхивали и помещали в термостат при 37°С до того времени, когда в луночках, контролирующих активность исследуемого материала, исходный цвет питательной среды сменится на желтый. Время конверсии цвета в этих контрольных лунках зависело от концентрации жизнеспособных микробов в исследуемом материале (обычно 3-6 часов). После чего приступали к учету результатов анализа. Сохранение исходного цвета питательной среды свидетельствовало об эффективности данной концентрации антибиотика, а появление желтого цвета - о недостаточной его концентрации, не способной подавить активность бактерий.
Минимальную нейтрализующую концентрацию (МНК) определяли как концентрацию антибиотика (мкг в мл) в последней не пожелтевшей луночке.
В экспериментах в качестве микробных агентов использовали лабораторные культуры Escherichia Coli штамм К-12 и Staphilococcus aureus штамм Wood, которые выращивали на гидролизатном питательном агаре НИИ питательных сред (Махачкала, Россия). Цветную питательную среду, содержавшую 0,002% индикатора бромкрезолпурпур и 0,5% глюкозы, употребляли двух сортов, из которых один служил для приготовления растворов антибиотиков, а другой - для приготовления взвесей гнойного отделяемого из ран больных или взвесей бактериальных культур.
Объем добавленного в луночки материала определен в 0,05 мл, так как меньшие (0,002; 0,005; 0,01; 0,02 мл) и большие (0,1 мл) удлиняли время "проявления" активности в контрольных луночках.
Таблица 1 Активность антибиотиков в луночках планшета после 2-недельного встряхивания (200 качаний/мин)
| Исследованный планшет | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гентамицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | |
| после встряхивания | 625 | 156 | 40 | 10 | <0,04 | 625 | 2,5 | 10 | 10 | 40 | 2,5 |
| после хранения в холодильнике | 625 | 156 | 40 | 10 | <0,04 | 625 | 2,5 | 10 | 10 | 40 | 10 |
Сравнение времени "проявления" активности в контрольных луночках при экспресс-методе и в ускоренном методе, в котором используются растворы антибиотиков, не выявили существенных различий. Экономия времени в экспресс-методе достигается за счет устранения этапа приготовления и размещения в планшете разведений антибиотиков. Переход высущенных антибиотиков в раствор при добавлении 0,05 мл исследуемого материала в луночку происходит в короткие сроки. Результаты использования экспресс-метода, в котором антибиотики были заранее высушены в луночках планшета, совпадали с результатами ускоренного метода, в котором применяли растворы антибиотика.
К достоинствам экспресс-метода следует отнести относительно длительное хранения в надлежащих условиях планшетов с высушенными в луночках антибиотиками без потери их антибактериальной активности (срок наблюдения 6 месяцев), в то время как в ускоренном методе приходится заботиться о сохранении активности в остатках раствора антибиотиков.
Встряхивание планшетов с высушенными антибиотиками в течение 2 недель при комнатной температуре (с перерывом на ночное время и выходные дни) не привело к сколько-нибудь заметному слущиванию с поверхности луночек высушенных антибиотиков и потере антибактериальной активности, если сравнивать эти показатели с аналогичными для планшетов, хранившимися при 4°C (табл. 1).
Необходимо подчеркнуть хорошую воспроизводимость результатов экспресс-метода на разных планшетах, нередко использованных в разное время. Как правило, получали совпадающие результаты.
Мы применяли зарубежные планшеты фирмы (Linbro, США) и планшеты отечественного производства (Медполимер, Россия). Каких-либо существенных различий в активности разных антибиотиков не отмечено (табл. 2).
При исследовании гнойного отделяемого ран мы определяли МНК и относим антибиотики к эффективным "Ч" (микрофлора отделяемого раны оказалась чувствительной к конкретному антибиотику) или неэффективным "У" (микрофлора отделяемого раны оказалась устойчивой к конкретному антибиотику). Из 9 обследованных больных в одном случае среди 11 антибиотиков не оказалось ни одного эффективного. В пяти случаях неэффективные антибиотики составили больше половины из 11, в остальных случаях их было менее половины. При отнесении антибиотиков к эффективным или неэффективным использовали численные показатели МПК, приведенные в [7, 9].
Для отбора наиболее эффективных антибиотиков использовали значение величины МНК. Иногда отбирали не один, а два антибиотика, в особенности, если они принадлежали к разным группам.
Методика определения расчетных показателей основывалась на сочетании полученных при анализе значений МНК и литературных данных [3, 4, 7, 9]. В начале определяли по данным литературы две величины: вводимых доз антибиотиков и соответствующих им концентраций антибиотиков в сыворотке (обычно отмечают наивысшие концентрации). Разделив первую величину на вторую, получали некую вспомогательную величину, которую обозначали как "коэффициент распределения антибиотика в сыворотке". Этот коэффициент не является сколько-нибудь постоянным, так как клиренс антибиотика приводит к возрастанию коэффициента, но мы его использовали в качестве ориентировочного для расчетов. Далее предположили, что непосредственно в гнойном отделяемом концентрация антибиотика заметно ниже, чем в сыворотке, оценив эту разницу предположительно в 10 раз. В этом случае и коэффициент распределения антибиотика в гнойном отделяемом возрастет в 10 раз по сравнению с коэффициентом для сыворотки. Теперь для того, чтобы определить дозу антибиотика, которую следует ввести для получения МНК, зафиксированную в таблице 3, следует пойти обратным ходом и умножить эту МНК на полученный коэффициент распределения антибиотика для гнойного отделяемого. Это произведение отражает, по нашему предположению, ту дозу антибиотика, которую необходимо ввести для того, чтобы в гнойном отделяемом найти экспресс-методом МНК в указанной в таблице 3 концентрации. Для устойчивого благоприятного результата антибиотикотерапии необходимо создать весомый избыток в сыворотке антибиотика над значением МПК. Поэтому мы в таблице 3 приводим такую расчетную дозу вводимого антибиотика, которая могла существенно превышать в гнойном отделяемом значение МНК, для чего увеличиваем эту дозу в 10 раз, по сравнению с дозой, обеспечивающей достижение концентрации антибиотика, равной МНК. Еще следует учитывать поправку, связанную с разведением раневого отделяемого перед исследованием экспресс-методом, если степень разведения известна хотя бы приблизительно.
Таблица 2 Сопоставление активности антибиотиков, высушенных в луночках отечественных (Медполимер) и зарубежных (Linbro) планшетов
| Производство планшетов | Номер планшета | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гента мицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | ||
| Медполимер | 1 | >625 | 625 | 40 | 2,5 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 |
| 2 | >625 | 625 | 40 | 40 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 | |
| Linbros | 1 | >625 | 625 | 40 | 40 | <0,04 | 625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 |
| 2 | >625 | >625 | 165 | 40 | <0,04 | >625 | 2,5 | 40 | 40 | 40 | 10 | |
Таблица 3 Влияние антибиотиков на гнойное отделяемое больных с целью определения МНК*) экспресс-методом и установление расчетной дозы предпочитаемого антибиотика для достижения его избытка в отделяемом раны
| NN п/п | Фами лия боль ного | Диагноз | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | Наиболее эффективный антибиотик | Вве дение анти биоти ка | Коэф фициент расп реде ления анти биотика в сыво ротке | Рас чет ная суто чная доза для дос тиже ния МНК в очаге пора же ния (мг) | Рас четная суто чная доза для дос тиже ния избы тка анти био тика (10*МК) в очаге пора жения (мг) | Опти маль ная суто чная доза анти био тика (мг) | Мак сима льная суто чная доза анти био тика (мг) | ||||||||||
| Ампи цил лин | Бен зил пен ицил лин | Стре птом ицин | Гент ами цин | Тет раци клин | Лин коми цин | Кла фо ран | Риф ампи цин | Цеф азо лин | Цеф ало тин | Це фат | ||||||||||
| 1 | Г-в | Гнойная рана голени | 40 У | 0,6 Ч | 625 У | 2,5 УЧ | 0,6 Ч | 625 У | 0,6 Ч | <0,04 Ч | 0,6 Ч | 0,15 Ч | 0,6 Ч | Рифампицин Цефалотин | внутрь в/в | 100000 20000 | 40 30 | 400 300 | 900 2000 | 1200 8000 |
| 2 | К-ко | Гнойная рана после ампутации бедра | <0,04 Ч | 156 У | 156 У | 156 У | 0,6 Ч | 625 У | <0,04 Ч | 10 У | 10 Ч | 156 У | 2,5 Ч | Ампициллин Клафоран | в/в в/в | 200000 10000 | 80 4 | 800 40 | 3000 1000 | 14000 2000 |
| 3 | Дем-в | Гнойная рана после обморожения | 2,5 Ч | <0,04 Ч | 10 УЧ | 2,5 УЧ | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | <0,04 Ч | Бензил пенициллин Тетра циклин | в/в внутрь | 700000 100000 | 300 40 | 3000 400 | 6000 1000 | 36000 2000 |
| 4 | З-в | Гнойная рана голени | >625 У | >625 У | >625 У | 625 У | 625 У | 625 У | 40 У | 156 У | 625 У | 625 У | 625 У | - | ||||||
| 5 | Ел-н | Гнойная рана стопы | 40 У | 2,5 У | 625 У | 625 У | 40 У | >625 У | 0,6 Ч | 2,5 УЧ | 40 У | 40 У | 10 УЧ | Клафоран | в/в | 10000 | 60 | 600 | 2000 | 12000 |
| 6 | Ар-ев | Нагноение после обморожения стопы | 156 У | 40 У | 156 У | >625 У | 156 У | 625 У | <0,04 Ч | 10 У | 40 У | 40 У | 2,5 Ч | Клафоран | в/в | 10000 | 4 | 40 | 2000 | 12000 |
| 7 | Кл-в | Гнойная рана после ампутации бедра | 625 У | 156 У | 625 У | 2,5 Ч | <0,04 Ч | >625 У | 2,5 Ч | 40 У | 10 Ч | 156 У | 2,5 Ч | Тетрациклин | внутрь | 100000 | 40 | 400 | 1000 | 2000 |
| 8 | Б-в | Послеопе рационная гнойная рана в паховой области | 625 У | 40 У | 156 У | 2,5 УЧ | 0,15 Ч | 156 У | <0,04 Ч | 2,5 УЧ | 10 Ч | 40 У | 0,6 Ч | Клафоран | в/в | 10000 | 4 | 40 | 2000 | 12000 |
| 9 | Во-в | Фурункул ягодицы | 40 У | 2,5 УЧ | 2,5 Ч | 0,15 Ч | 0,6 Ч | 0,6 Ч | 0,6 Ч | <0,04 Ч | 0,15 Ч | <0,04 Ч | 0,15 Ч | Цефалотин | в/в | 20000 | 30 | 300 | 2000 | 8000 |
Правая половина таблицы составлена на основании показателей, приведенных в литературе (объяснения изложены в тексте).
*) МНК - минимальная нейтрализующая концентрация.
Последние две графы в таблице 3 содержат сведения об оптимальной и максимально допустимой дозами антибиотиков, которые почерпнуты из современных литературных источников [3, 4, 9]. Они позволяют сопоставить расчетные значения вводимой дозы эффективных антибиотиков с оптимальными и предельными дозами. Во всех 9 случаях дозы, позволяющие создать избыток антибиотика в раневом отделяемом, ниже, чем те, которые считаются оптимальными. Если не использовать методы отбора эффективных антибиотиков, а применять антибиотики, рекомендованные до определения возбудителя и его чувствительности [9], то нередко создать избыточную концентрацию рекомендуемого для конкретной болезни антибиотика вряд ли удастся (даже если МНК составляет 10 мкг/мл), так как она заметно превышает максимально допустимую дозу.
Оказалось, что для экспресс-метода можно использовать не только гнойное отделяемое, но и экстракт повязок или салфетки, накладываемой на рану. В нескольких случаях мы параллельно использовали как гнойное отделяемое, так и экстракт участка перевязочного материала, и получали, как правило, совпадающие результаты. Один из таких протоколов приведен в таблице 4.
Обсуждение результатов
Ускоренный метод отбора эффективных антибиотиков [1, 5] предлагает применение растворов антибиотиков, что, с практической точки зрения, менее удобно, чем использование планшетов с заранее высушенными антибиотиками в экспресс-методе, когда бактериологу остается лишь внести в луночки планшета по 0,05 мл исследуемого материала, а затем следить за конверсией цвета в термостате. Сокращение времени анализа в экспресс-методе достигается за счет избавления от необходимости тратить время на приготовление разведений антибиотиков в луночках.
Преимущество экспресс-метода обеспечивает возможность сохранения планшетов с заранее высушенными антибиотиками, отсутствие каких-либо различий в антибактериальной активности у отечественных и американских планшетов, отсутствие влияния многочасового встряхивания готовых планшетов и высокая воспроизводимость результатов. Методика экспресс-метода столь неприхотлива, что может выполняться, после надлежащей подготовки, средним медицинским персоналом.
В настоящей работе использован новый термин - минимальная нейтрализующая концентрация - МНК, которая не совпадает с определением минимальной подавляющей концентрации - МПК. Эта последняя величина МПК определяется диско-диффузионным методом в относительно стандартных условиях (на агар наносится определенное число микробных клеток с последующим замером зоны задержки роста бактерий и переводом диаметра этой зоны в МПК). Что касается МНК, то мы исходим из того, что отделяемое раны обладает способностью в условиях термостата изменять исходный цвет питательной среды в желтый, а антибиотик нейтрализует этот эффект. При этом величина МНК в значительной степени зависит от вида (видов) микроорганизма в отделяемом и его концентрации. В конкретном случае регистрируется лишь цветовой эффект и его нейтрализация. Исследование посевов из луночек с неизменным цветом питательной среды показало, что в некоторых случаях обнаруживаются жизнеспособные бактерии, хотя и в небольшом числе, а в других случаях их там не обнаруживают. Относительно быстрое определение МНК позволяет оценивать активность разных антибиотиков в отношении микробной обсеменен-ности отделяемого раны обычно в день взятия материала на исследование, в то время как определение на МПК запаздывает на несколько суток, когда ситуация в ране может измениться.
Таблица 4 Сопоставление результатов определения активности антибиотиков при исследовании гнойного отделяемого и экстракта участка повязки на ране больного Б-ва.
| Исследованный материал | Антибиотики (МНК - мкг/мл) | ||||||||||
| Ампи циллин | Бензил пени циллин | Стреп томицин | Гента мицин | Тетрациклин | Линкомицин | Клафоран | Рифампицин | Цефазолин | Цефалотин | Цефат | |
| гнойное отделяемое | 625 | 40 | 156 | 2,5 | 0,15 | 156 | <0,04 | 2,5 | 10 | 40 | 0,6 |
| экстракт повязки на ране | 625 | 40 | 156 | 2,5 | 0,15 | 156 | <0,04 | 2,5 | 2,5 | 10 | 0,6 |
Расчетные значения вводимых в организм больного доз антибиотиков позволяют ориентироваться в отношении возможного избытка антибиотика в гнойном отделяемом. Эти расчеты базируются на некоторых, вероятно, не всегда корректных допущениях. Рассчитать градиент падения концентрации антибиотика от сыворотки к гнойному отделяемому не просто, во всяком случае, мы располагаем лишь предположениями на этот счет. Что касается избытка антибиотика в раневом отделяемом, то и здесь нет достоверных сведений, хотя мы не теряем надежду разработать соответствующую методику в недалеком будущем. В любом случае желательно обладать подобными сведениями для каждого конкретного больного, нуждающегося в антибиотикотерапии.
Существенным облегчением для определения МНК можно считать возможность анализа не только гнойного отделяемого, но и элементов перевязочных средств. В последнем случае можно было бы опасаться массивных количеств случайных бактерий, но использование стерилизованных перевязочных материалов, вероятно, отвергает эти опасения, как свидетельствует наш небольшой опыт. За относительно короткое время, затрачиваемое экспресс-методом, возможные незначительные количества посторонних бактерий не могут эффективно конкурировать с микробной флорой гнойного отделяемого из-за способности изменять цвет питательной среды.
Рациональная антибиотикотерапия складывается из быстрого выбора эффективных антибиотиков и вводимой дозы, способной создать избыток в очаге поражения, убежденности в том, что такой избыток достигнут, и определения длительности лечения с помощью антибиотиков. Желательно, чтобы эти рекомендации были выбраны исходя не из общих соображений, а конкретно для каждого больного. Первые три показателя должны быть получены в результате сочетанной работы клинициста, клинического бактериолога и клинического фармаколога, а длительность лечения - это, скорее, прерогатива лечащего врача, основывающегося на результатах первых дней применения этиотропного лечения.
Выводы
1. Применение планшетов с заранее высушенным в луночках антибиотиками сокращает время, затрачиваемое на отбор наиболее эффективных антибиотиков, и существенно упрощает сам анализ.
2. Экспресс-метод отбора эффективных антибиотиков был апробирован в анализе гнойного отделяемого и перевязочного материала ран нескольких больных. Расчетные данные, основанные на результатах исследования конкретных больных в сочетании со сведениями, почерпнутыми из литературных источников, позволили оценить возможные дозы антибиотиков, необходимые для сооздания их избытка в гнойном отделяемом.
Литература
1. Леви М.И, Горожанкина И.А., Сагатовская Л.А.
Быстрый метод определения чувствительности бактериальных
культур к различным антибиотикам в жидкой среде.
Антибиотики, 1967, N1, с. 57-62.
2. Леви М.И., Сучков
Ю.Г., Прохоров В.Я., Терушкин В.А. Ускоренный отбор
эффективных антибиотиков для лечения больных
госпитальными инфекциями. Дезинфекционное дело, 1999,
N3, с. 18-24.
3. Лекарственные препараты зарубежных
фирм в России. Справочник. М.,
"Астрафармсервис", 1993.
4. Машковский И.Д.
Лекарственные средства. Т.2, Изд. 13, М., 1998.
5.
Методические рекомендации по ускоренному отбору
эффективных антибиотиков для лечения больных
госпитальными инфекциями. Утверждены МЗ РФ 10.01.2000 г.
за N1100/26-0-117. Дезинфекционное дело 1999, N3,
Приложение.
6. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная
антибиотикотерапия. Изд. 4, М., 1982.
7. Сидоренко
С.В., Колупаев В.Е. Антибиотикограмма:
диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов.
Изд. группа "Арина", 1999.
8. Сидоренко
С.В., Федорович В.Ю. Ускоренный метод определения
минимальной подавляющей концентрации антибиотиков на
планшетных спектрофотометрах со встроенным термостатом.
В кн.: "Внутрибольничные инфекции - проблемы
эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и
профилактики", М., 1999, с. 220-221.
9. Сэнфорд
Дж., Гилберт Д., Гербердинг Дж., Сэнде М. Антимикробная
терапия. Изд. 23., М., 1996.