Медицинское законодательство
Приложение N 6
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО УДАЛЕНИЮ ИЗ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИТЕЛ ДРУГОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ
Общие сведения
В практической работе по определению резус-принадлежности
крови наибольшее удобство представляет использование сывороток
антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых
агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются
универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность
в крови любой группы по системе АВО.
Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и
В(III), также могут быть превращены в универсальные путем
абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и
бета.
Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки
антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные
антитела другой специфичности, чаще всего анти-С и анти-Е. Если
эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи
абсорбции или путем разведения сыворотки.
Использование универсальных сывороток антирезус упрощает
работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает
получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы
сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов.
Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа,
бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:
а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической
жидкости (см. п. 1);
б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского)
(см. п. 2);
в) абсорбцию групповых агглютининов альфа и бета
резус-отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови
после снятия с них сыворотки (см. п. 3);
г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем
разведения сыворотки (см. п. 4);
д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой
специфичности (см. п. 5);
е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения
сыворотки (см. п. 6).
1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощи
амниотической жидкости<*>
Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую
субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть
использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная
и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку
амниотической жидкости см. п. 8).
--------------------------------
<*> - Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgМ, неполные альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgG, при этом не нейтрализуются.
Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке
антирезус группы Оальфа бета(I) используют амниотическую жидкость
группы АВ(IV) или смесь образцов амниотической жидкости групп
А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке
группы Абета(II) используют амниотическую жидкость группы В(III).
Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы
Вальфа(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).
Для полного истощения групповых агглютининов в исходной
сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для
чего:
- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, во все пробирки вносят по 2 капли
амниотической жидкости - нативной или растворенной после
высушивания;
- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой
сыворотки, во вторую 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую -
10 капель, в пятую - 12 капель;
- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при
комнатной температуре;
- после 10-минутной экспозиции смесь из каждой пробирки
контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими
антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;
- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация
(время наблюдения 5 минут), принимается за оптимальное соотношение
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;
- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят
разведения 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано
выше;
- после того, как выбрано оптимальное соотношение, к основному
объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество
амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 минут после
перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на
плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы
А(II) и В(III);
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Примечание:
В целях упрощения получения универсальных сывороток из
сывороток антирезус группы Абета(II) и Вальфа(III) их можно
предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать
одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью
группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и
группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки
противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом
происходит частичная взаимная нейтрализация групповых
агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости,
необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается
степень разведения абсорбируемой сыворотки.
Использование высушенной амниотической жидкости
При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее
разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно
использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с
определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого
порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:
- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в
которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;
- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической
жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг.
Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и
оставляют при комнатной температуре;
- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту
нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают
оптимальное соотношение ингредиентов;
- выбранное соотношение используют для изготовления основного
объема сыворотки;
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
естественными групповыми веществами специфичности А и В
(субстанция Витебского)
Групповые специфические вещества А и В являются
высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в
производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных
желудков путем их ферментативного переваривания с последующим
осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество
группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации
антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус
добавляют групповое специфическое вещество из расчета:
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового
вещества А и 0,1 г - группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г
группового вещества В;
к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III)- 0,1 г группового
вещества А.
Для растворения группового вещества необходимое его количество
сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом
стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус,
подогретой до 37ш С, затем это групповое вещество переносят в
общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая
его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с
групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая
каждые 30 минут.
После этого сыворотку помещают в холодильник при 4ш С не
менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на
содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами
резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).
Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины
полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную
нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют
такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и
вся процедура повторяется.
При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку
исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по
изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными
эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)
Неотмытые свертки крови группы АВ(IV), оставшиеся после
отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8ш С в
течение 1-2 суток.
Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи
стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку
антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему,
занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают
50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности
групповых антител). Сыворотку, тщательно смешанную со свертком,
оставляют на 18-20 часов при 4-8ш С, после чего отделяют от
свертка путем центрифугирования.
Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус-
отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых
агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим
раствором NaCl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным разводителем.
Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна
только лишь при большом различии титра групповых и резус-антител.
Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует
развести не менее, чем в 16 раз, что возможно только в том случае,
если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже
требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.
В процессе работы в начале следует приготовить пробные
разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а
также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами
резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).
При сохранении достаточного титра резус-антител и полноте
абсорбции групповых антител разводят основной объем сыворотки
антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антител
анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D
выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус,
последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения
сыворотки.
Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми
приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если
в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции
применяются эритроциты фенотипа Ccddee, а если имеется примесь
анти-Е, то эритроциты фенотипа ccddEe. Абсорбция проводится в
течение 2-3 час. при температуре 37ш С при помешивании с
последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность.
Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.
Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих
антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже, чем
1:128 - 1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.
Сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCl,
сывороткой - разводителем или стандартным разводителем.
В начале следует сделать пробные порции, которые исследовать
на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность
достаточного титра резус-антител-D. При положительном результате
разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции, так и
после разведения основного объема сыворотки ее вновь обрабатывают
и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению
стандартных сывороток и реагента антирезус".
6. Получение и обработка амниотической жидкости для
использования ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой
роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть
получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию
роженицы, дату взятия, количество и по возможности группу крови
новорожденного.
Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует
группе крови новорожденного.
Оплата за сбор амниотической жидкости производится
учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную
кровь из средств на заготовку крови.
Подготовка амниотической жидкости к использованию
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают
путем определения групповой принадлежности крови новорожденного
или методом истощения агглютининов альфа и бета в
гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке
смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей
сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь
перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре.
Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на
плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III).
Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно
1:10, экспозиция 5-7 минут.
Трактовка результатов
- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и
группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости
групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе
О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации
групповых агглютининов.
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II)
и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на
принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).
- Отсутствие агглютинации в каплях как с эритроцитами группы
А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность
амниотической жидкости к группе АВ(IV).
Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую
наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую
жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать
каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых
агглютининов.
Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы
А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой
принадлежности крови.
Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости
групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден
для работы.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на
специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный
бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера,
в которую помещают измельченную фильтровальную бумагу толщиной
5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится
прозрачной.
Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр
на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.
Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8ш С.
Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость
высушивают по 150-200 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На
флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической
жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты
высушивания.
Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной
температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую
жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до
исходного объема. После растворения используют аналогично
нативной.
Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус
антител другой специфичности", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/136, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 7
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
I. ВВЕДЕНИЕ
Определение резус-принадлежности заключается в выявлении в
эритроцитах людей антигена D системы Резус.
В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, C, c, E, e,
которые определяют с помощью соответствующих антисывороток.
Антиген d серологически не выявляется. Существуют также
разновидности антигенов резус: Du, Cw, cv, cx и другие.
Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:
D - 85%
C - 70% c - 80%
E - 30% e - 97,5%
Антигены системы Резус обладают способностью вызывать
образование изоиммунных антител.
Наиболее активным в этом отношении является антиген D, который
и подразумевается под термином резус-фактор. Именно по наличию
или отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительных
и резус-отрицательных.
Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людей
составляют 28 групп системы Резус (Табл. 1). В четырнадцати из них
содержится антиген D - они являются резус-положительными, а другие
четырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - их
относят к резус-отрицательным.
Таблица 1
СИСТЕМА РЕЗУС
+-----+------------------------------------------------------------+
| N | Резус-положительные |
| +----------------------+-------------+----------+------------+
| п/п | Фенотип | Частота в % | Генотип |Частота в % |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 1-2 | CCDEE CwCDEe | 0,00 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 3 | ССDEe | 0,07 | CDE/CDe | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 4 | CcDEE | 0,035 | CDE/cdЕ | 0,006 |
| | | | cDE/CdE | 0,029 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 5 | CcDEe | 13,69 | CDe/cDE | 12,24 |
| | | | CDE/cDe | 0,01 |
| | | | CDe/cdE | 0,97 |
| | | | cDE/Cde | 0,27 |
| | | | CDE/cde | 0,19 |
| | | | cDE/cdE | 0,006 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 6 | CwcDEe | 1,23 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 7 | ccDEe | 11,82 | cDE/cde | 10,04 |
| | | | cDE/cDe | 0,72 |
| | | | cDe/cdE | 0,06 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 8 | ccDEE | 2,49 | cDE/cDE | 2,16 |
| | | | cDE/cdE | 0,33 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 9 | CcDee | 31,93 | Cde/cde | 29,90 |
| | | | CDe/cDe | 1,98 |
| | | | cDe/Cde | 0,05 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 10 | CwcDee | 2,38 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 11 | CCDee | 16,81 | CDe/Cde | 16,01 |
| | | | CDe/Cde | 0,80 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 12 | CwCDee | 2,60 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 13 | CwCwDe | 0,00 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 14 | ccDee | 2,21 | сDe/cde | 2,10 |
| | | | cDe/cDe | 0,11 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| Резус-отрицательные |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 15 | ccddee | 12,71 | cde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 16 | Ccddee | 1,54 | Cde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 17 | CCddee | 0,03 | Cde/Cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 18 | Cwcddee | 0,035 | Cwde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 19 | ccddEe | 0,070 | cde/cdE | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 20 | CcddEe | 0,35 | Cde/cdE | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
|21-28| CwCddee CwCwddee | | | |
| | ccddEE CcddEE | 0,00 | | |
| | CCddEE CCddEe | | | |
| | CcddEe CwCddEe | | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. Определение резус-принадлежности.
Определение резус-принадлежности производится специалистом,
имеющим специальную подготовку.
Определение резус-принадлежности реципиентов производится
стандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить их
на резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (rh-).
В отличие от реципиентов определение резус-принадлежности
крови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноров
исследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров,
давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуют
дополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащими
антитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть в
сыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителами
анти-D, например: анти-D+C, анти-D+E или анти-D+C+E.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками,
т.е. не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, C, E.
Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить и
у других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и у
беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров
записывается в специальных листах или журнале и на лицевом листе
донорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц,
производивших определение.
Результат определения резус-принадлежности крови больных и
других лиц записывается в специальный журнал и на бланке с
указанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этот
бланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат,
указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правом
верхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется его
подписью с указанием даты.
2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.
Сыворотки антирезус изготавливаются обычно в виде
"универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В.
Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежности
крови людей любой группы по системе АВО.
Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групп
по системе АВО, то в этих случаях при определении
резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность
сыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяется
резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I); сывороткой
антирезус группы А(II)- только в эритроцитах групп О(I) и А(II);
сывороткой антирезус группы В(III) - только в эритроцитах групп
О(I) и В(III); сывороткой антирезус группы АВ(IV) и специально
приготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется в
эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.
3. Контрольные исследования.
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учету
крови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовления
стандартных эритроцитов".
4. Особенности стандартных сывороток антирезус.
Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности
могут содержать резус-антитела, разные по форме - полные и
неполные (см. "Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особых
условиях, поэтому методика определения резус-принадлежности
зависит от того, какие резус-антитела находятся в стандартной
сыворотке.
Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус
указывается в сопроводительной инструкции.
III. РАЗЛИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
Метод определения резус-принадлежности зависит от формы
антител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.
При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая
сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого
предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.
1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации с
применением желатина в пробирке с подогревом 46-48ш С.
а) Специальное оснащение.
Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.
Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.
Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.
Водяная баня 46-48ш С. Суховоздушный термостат 46-48ш С.
10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом
- сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на
10 мл 10% раствора желатина).
Лупа с 2-4-кратным увеличением.
б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных
эритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве
5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать
фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при температуре
+4-8ш С.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты использовать для
исследования.
Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из
места укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в
пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с
желатином 1:2.
в) Техника определения. В штатив устанавливают два ряда
пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и
по две пробирки для стандартных резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные
пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл)
стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.
Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл)
10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.
Второй ряд является контролем для исключения возможного
неспецифического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая
желатиновая проба).
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48ш С на 15 минут или в
суховоздушный термостат на 25-30 минут.
При извлечении пробирок из водяной бани или термостата
доливают в них 5-8 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на свет
невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробирках
второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
(прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичности
реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой
антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях
рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим
раствором NaCl для элюирования с них аутоантител и повторить
исследование. При сомнительном результате для определения
резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в
солевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащих
полные антитела.
2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного
универсального реагента (в пробирках без подогрева).
Специальное оснащение.
стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;
33% раствор полиглюкина;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;
лупа с 2-4-кратным увеличением.
Предварительная обработка исследуемой крови не требуется.
Может быть использована кровь, взятая непосредственно перед
исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для
стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого
исследуется.
Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли
(0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33%
раствора полиглюкина.
В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно
маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки,
предназначенные для контроля, вводят стандартные
резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое
растекание крови по стенкам пробирок делает реакцию более
выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивого комплекса
антиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в виду
возможности замедленной реакции при слабо выраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
0,85% раствора NaCl и перемешивают содержимое 2-3-кратным
перевертыванием пробирок, не встряхивая.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной
(rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами,
отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра
результатов во 2-ом контрольном ряду.
Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть не
должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и,
следовательно, не позволяет учесть результат исследования как
истинный.
В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты
теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с них
аутоантител и повторить исследование.
В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности
следует применить метод агглютинации в солевой среде, используя
сыворотку с полными антителами.
3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в
сывороточной среде на плоскости с подогревом.
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пластмассовые пластины;
водяная баня 46-48ш С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычные
пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно
после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое
количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции.
Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть
сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Эритроциты используют для исследования в виде 5-10% взвеси в
собственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробирках
путем встряхивания содержимого.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника определения.
На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большой
капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали,
всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Кроме
того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной
сыворотки группы АВ (IV), не содержащей резус-антител (контроль на
неспецифическую агглютинацию).
К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю
(0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой
серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных,
одноименных с группой крови больного или группы О(I), и к третьей
капле каждой серии 1 каплю (0,05 мл) контрольных
резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой
крови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткой
группы АВ (IV), не содержащей резус-антител, добавляют 1 каплю
(0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной
палочкой и пластину опускают в водяную баню при 46-48ш С на 10
минут.
Трактовка результатов.
Результаты исследований просматривают при легком покачивании
пластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы на
почти обесцвеченном фоне жидкости.
При отрицательном результате капля остается равномерно
окрашенной в красный цвет.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+).
Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой
анти-D, являются резус-отрицательными (rh-). Однако эти
результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих
сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов
эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), а также при отрицательном
результате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), не
содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле
говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно,
положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен
как истинный. В этих случаях резус-принадлежность следует
определять, применяя другие методы исследования.
4. Определение резус-принадлежности реакцией
агглютинации в солевой среде
Специальное оснащение.
стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким
дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций с
углублениями такой же конфигурации и объема;
лупа с 2-4-кратным увеличением;
термостат 37ш С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке
надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого
взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки
доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое их
перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего 1
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl.
2% взвесь эритроцитов употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника определения.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей.
Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегка
накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки.
Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и
инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
Во все пробирки (лунка планшета) первого ряда вводят по 1
капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки
(лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус
другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле
изотонического раствора NaCl.
В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси испытуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
контрольных (стандартных) резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов.
Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в
термостат при 37ш С на 1 час. Можно затем оставить пробирки на
столе при комнатной температуре еще на 1,5-2 часа до учета
результата.
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя
в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси
над источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше,
чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-).
Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в
обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных
образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I).
Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген Du.
Повторное использование сыворотки. После определения
резус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасывают
сыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку.
Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять для
определения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет,
т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартными
резус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
IV. ОБЩИЕ ПРИМЕЧАНИЯ
1. При определении резус-принадлежности независимо от метода
определения результат учитывается как истинный после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
каждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в других
контрольных пробах, применяемых для каждого метода.
2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается
слабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследовать
кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими
методами, включая метод агглютинации в солевой среде с
сыворотками, содержащими полные антитела.
Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные
антитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными
антителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты
содержат слабую разновидность антигена резус, так называемый
антиген Du, частота которого около 1%. В этих случаях
резус-принадлежность крови больного или беременной женщины
указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежность
крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская таким
образом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.
V. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУС
При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С,
анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетании
с анти-D, например D+C; D+E; D+C+E, применяются те же методы, что
и при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом
учитывается форма антител.
В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и не
содержащие соответствующий антиген.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990
года N 05-14/29, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 8
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
НА ПЛОСКОСТИ БЕЗ ПОДОГРЕВА И ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ
СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ И РЕАКТИВА АНТИРЕЗУС,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЭТОЙ ЦЕЛИ
Общие сведения
Методы определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения
особого лабораторного оборудования непосредственно у постели
больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при
массовых обследованиях.
Методы основаны на использовании сывороток антирезус,
изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин,
полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела
приобретают способность агглютинировать резус-положительные
эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично
реакции по определению групп крови АВО.
Наиболее удобными для практики являются методы определения на
плоскости без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива
антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с
сухим полиглюкином и альбумином.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости
без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
приготовленной с альбумином
(прилагается при выдаче сыворотки)
Оснащение:
а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус
анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8ш С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и
справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями
наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с
сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до
получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в
течение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле
изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической
агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения
5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет - кровь
остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
При наличии агглютинации в контрольной капле, что может
произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет
аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими
методами, желательно в лабораторных условиях.
2. Определение резус-принадлежности при помощи
реактива антирезус, изготовленного с использованием
сухого полиглюкина
(прилагается при выдаче реактива)
Оснащение:
а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в
комплекте с контрольным реактивом;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором не более, чем за 2 суток до исследования. Кровь
хранят при 4-8ш С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее слева 1 каплю реактива антирезус и справа - 1 каплю
контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к
контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.
Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по
пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку
периодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обе
смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капель
изотонического раствора NaCl.
Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут,
после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии
агглютинации в контроле.
При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при
некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь
необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в
лабораторных условиях.
3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности
на плоскости без подогрева
Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D.
Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей
резус-антител. Сыворотка предназначена для определения
резус-антигена D.
Материалом для изготовления сыворотки антирезус в сочетании с
альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или
специально приготовленная - универсальная с титром неполных
резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса.
Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана
годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.
Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям,
предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам
системы АВО.
При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином
необходимы:
- альбумин 20-30% раствор, полученный из плазмы крови
человека;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови,
взятой на гепарине;
- гепарин;
- изотонический раствор NaCl.
Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора
оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор
можно вести двумя способами:
а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней
разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец
альбумина с высокой конглютинационной активностью;
б) используя один и тот же образец (серию) альбумина,
испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.
Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью.
Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128
разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцами
раствора альбумина.
Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на
пластинке с 5-6 образцами (Rh+) и с 5-6 образцами крови ccddee, а
также с кровью фенотипа Ccddee и ccddEe.
Сыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2
точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле
(0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли
перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя.
Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления и величине
агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии
агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании
этого отбирают образцы альбумина наиболее пригодные для
использования.
Для последующего использования применяют образцы альбумина,
при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов
появляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая
аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной
активностью в альбуминовой среде
Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят
отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к
ним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.
Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней
по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной
крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения
тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании
пластинки.
Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца
сыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6
образцами ccddee, а также с кровью фенотипа Сcddee и ccddEe.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию
с резус-отрицательными эритроцитами ccddee и эритроцитами генотипа
Ccddee и ccddEe.
Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус
анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация
резус-положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30
секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных
эритроцитов и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и
альбумина.
После выбора, альбумина с наиболее высокой конглютинирующей
способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой
агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к
подбору оптимального их соотношения, для чего:
в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;
в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии
альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую
- 8 и в пятую - 10 капель;
в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки
антирезус и содержимое тщательно перемешивают;
из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на
пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;
во все капли 1-го ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей
резус-положительной крови, во 2-ой ряд - резус-отрицательной крови
(кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови).
Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при
покачивании пластинки.
Учет и оценка результатов.
Четкая агглютинация Rh+ эритроцитов и отсутствие агглютинации
rh- эритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe
указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки
антирезус и альбумина.
Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус
анти-D в сочетании с альбумином
Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки
используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и
альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые
применялись для установления оптимального их соотношения.
К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином
добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сыворотки.
Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках
с 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцами
резус-отрицательных ccddee, а также с эритроцитами фенотипа Сcddee
и ccddEe.
При наличии четко выраженной агглютинации с
резус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, и
отрицательной реакции с резус-отрицательной кровью ccddee и кровью
фенотипа Ccddee и ccddEe, сыворотку антирезус в сочетании с
альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки
анти-D для определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева.
Исследование проводят с одновременным параллельным
использованием контрольной сыворотки.
Изготовление контрольной сыворотки.
Для изготовления контрольной сыворотки используют
изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней
альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в
соотношении, которые были использованы для приготовления данной
серии сыворотки антирезус.
Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано
выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна
вызывать агглютинацию эритроцитов.
Консервирование сыворотки.
Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют
борной кислотой из расчета 2 г. на 100 мл сыворотки.
Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и
контрольной сыворотки
Сыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которые
запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми
пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием
учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки,
метода, для которого она предназначена, количества, номера серии
и срока годности.
Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер
серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной
сыворотки антирезус.
Хранение, срок годности и контроль.
Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином и
контрольные сыворотки хранят при 4-8ш С.
Срок годности - 4 месяца.
По истечении срока годности, но при сохранении активности и
специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1
месяц.
Выдача сыворотки антирезус.
Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной
сывороткой.
К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.
+-------------------------+ +-------------------------+
| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|
| изготовителя | | изготовителя |
+-------------------------+ +-------------------------+
| Сыворотка антирезус-D | | Контрольная сыворотка |
| для метода на плоскости | | для метода на плоскости |
| без подогрева | | без подогрева |
| Для всех групп крови | | Для всех групп крови |
| системы АВО | | системы АВО |
| Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ |
| Годна до __________ | | Годна до __________ |
+-------------------------+ +-------------------------+
Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной
сыворотки.
4. Изготовление реактива антирезус с использованием
сухого полиглюкина для определения резус принадлежности
на плоскости без подогрева
Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D,
представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При
хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с
контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.
Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные
сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные
- универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 -
1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть
предварительно исследована и признана годной, как стандартная
сыворотка антирезус.
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная
сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к
стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении реактива антирезус необходимы:
- полиглюкин, высушенный лиофильным способом;
- альбумин-2,5% раствор;
- изотонический раствор NaCl;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.
Примечания:
1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном
аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку
ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.
2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20%
раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором
NaCl.
Изготовление реактива антирезус.
Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем
1:64 - 1:128<*> переносят во флакон с предварительно высушенным
полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина,
высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация
полиглюкина составит 6%.
---------------------------------
<*> - Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром
можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV),
стандартным разводителем или 2,5% раствором альбумина в
изотоническом растворе NaCl.
Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания
до полного растворения порошка полиглюкина.
Изготовление контрольного реактива.
Для изготовления контрольного реактива в другой такой же
флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют
стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до
исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до
полного растворения порошка полиглюкина.
Исследование качества изготовленных реактивов.
Исследование реактивов производят непосредственно после их
изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными
эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности
реакции:
на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл)
реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного
реактива;
в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл)
резус-положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной
капле резус-отрицательных эритроцитов. Содержимое капель
перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и
оставляют на три минуты периодически покачивая пластинку;
через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель
изотонического раствора NaCl, перемешивают и через две минуты
учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами
резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных
эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты
Ccddee и ссddEe.
Учет и оценка результатов.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее
с резус-отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитами
фенотипа Ccddee и rccddEe.
Показателем пригодности реактива для последующего
использования является наличие крупнозернистой агглютинации
резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1
минуты и отсутствие ее с резус-отрицательными эритроцитами
(ccddee) и эритроцитами фенотипа CcddEe и ссddEe.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для
реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна
отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов.
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной
кислотой из расчета 2 г. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация.
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы
запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и
завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения,
изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого
он предназначен, количества,номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов), и также наклеивают этикетки с
соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива
повторяет номер серии основного реактива антирезус.
+-------------------------+ +-------------------------+
| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|
| изготовителя | | изготовителя |
+-------------------------+ +-------------------------+
| Реактив антирезус-D | | Контрольный реактив |
| для метода на плоскости | | для метода на плоскости |
| без подогрева | | без подогрева |
| Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ |
| Годен до __________ | | Годен до __________ |
+-------------------------+ +-------------------------+
Хранение, срок годности и контроль.
Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и
контрольный реактив хранят при 4-8ш С. Срок годности 4 месяца.
Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на
активность и специфичность через месяц.
Выдача реактива антирезус.
Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным
реактивом.
К каждому комплекту (или набору комплектов) придается
инструкция по использованию.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 06 декабря 1990 года N
05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 9
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-D
ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЖИДКОГО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
D АНТИГЕНА СИСТЕМЫ РЕЗУС
(АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИ-D)
ТУ 9398-215-27575295-95)
1. Назначение
Цоликлон анти-D предназначен для выявления D антигена системы
резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах
взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен
"Инструкцией по определению резус-принадлежности крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в
1997 году и Методическими рекомендациями по определению
резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994
года.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D
Действующим началом Цоликлон анти-D являются моноклональные
анти-D антитела, продуцируемые лимфобластоианой линией клеток
человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D
антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются
моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов,
полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D
антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена
контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.).
Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках
во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через
кровь.
Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленную или
разведенную солевым раствором культуральную жидкость,
кондиционированную клетками-продуцентами антител. Анти-D
моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G
(IgGl). Цоликлон анти-D не содержит антител иной специфичности и
поэтому может быть использован для выявления D антигена в
эритроцитах любой группы крови.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G
(неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов,
содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции
конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе
Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных
протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных
системах типа "Группоматик".
3. Техника определения D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови,
стабилизированной с помощью применяемых консервантов; в крови,
взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая
реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой
концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в
исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции
агглютинации.
3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)
Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена.
Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе трижды отмытых
исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл
взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату ((0,05
мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют в
течение 45-60 минут при 37ш С. Затем после однократного отмывания
физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1
мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно
или через 15-30 минут инкубации при комнатной температуре
центрифугируют при 200 g в течение 15-20 секунд. Осадок мягко
взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или
микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в
исследуемых эритроцитах.
3.2. Реакция конглютинации с желатином
В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл)
свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или
эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли
(0,1-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при
45-50ш С до разжижения, и одну каплю Цоликлона анти-D. Суспензию
тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или
30 минут в термостате при 48ш С, прибавляют 5-6 мл
физиологического раствора и после осторожного переворачивания
пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация
эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.
3.3. Реакция с препаратом на основе полиглюкина
Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую
агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно
объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его
слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим
использование полиглюкина для моноклональных антител не
рекомендуется.
3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными
протеолитическими ферментами
Цоликлон анти-D, содержащий моноклональные антитела класса
IgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных
эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как
бромелин, папаин и др., и поэтому может применяться в
автоматических системах типирования крови.
3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики исследования) необходимо использовать
стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
Желательно также включение образцов со слабовыраженным D
антигеном.
4. Форма выпуска
Цоликлон анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом
5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта
применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в
закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение
реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным,
протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией
направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-D диагностического
жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела
моноклональные анти-D)", утвержденную Главным техническим
Управлением Минздрава СССР 21 августа 1990 года, считать
утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 10
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ АНТИ-D IgM МОНОКЛОНАЛЬНОГО РЕАГЕНТА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-D СУПЕР)
ТУ 9398-206-27575295-94
1. Назначение
Цоликлон анти-D Cупер предназначен для выявления антигена D
системы резус в эритроцитах человека.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен
"Инструкцией по определению резус-принадлежности крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в
1997 году, и Методическими рекомендациями по определению
резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994
года.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
В связи с тем, что IgM антитела не вызывают агглютинации
некоторых образцов эритроцитов со слабовыраженным D антигеном
(Du), образцы донорской крови, которые при исследовании Цоликлоном
анти-D Супер были определены как D-отрицательные, необходимо
дополнительно тестировать с помощью анти-D реагентов, содержащих
IgG-антитела (поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D
IgG реагентом).
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D Супер
Действующим началом Цоликлон анти-D Супер являются
моноклональные анти-D антитела, которые продуцируются
гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой
лимфобластоидной линии и миеломной клеточной линией мыши.
Цоликлон анти-D Супер изготовлен на основе культуральной
жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител Анти-D.
Реагент не содержит антител иной специфичности и поэтому может
быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой
группы крови.
Моноклональные антитела, принадлежат к одному классу
иммуноглобулинов - IgM, полностью идентичны по структуре и
биологической активности. Анти-D антитела класса М являются
полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию
эритроцитов, содержащих D антиген. Цоликлон анти-D Супер может
быть использован для выявления D антигена в любых вариантах прямой
реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микроплате.
3. Определение D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови,
стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в
крови, взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
На пластину со смачиваемой поверхностью нанесите большую каплю
(около 0,1 мл) реагента. Рядом поместите маленькую каплю
(0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешайте кровь с реагентом.
Наиболее крупная агглютинация наблюдается при использовании
эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает
развиваться через 10-15 секунд, четко выраженная агглютинация
наступает через 30-60 секунд. Использование подогретой до 37-40ш С
пластинки сокращает время наступления агглютинации. Результаты
реакции учитывайте через три минуты. Пластинку после смешивания
реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30
секунд, что позволяет за это время развиться более полной
крупнолепестковой агглютинации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
В круглодонную пробирку внесите одну каплю (около 0,1 мл)
реагента и добавьте одну каплю 5% суспензии исследуемых
эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки
тщательно перемешайте встряхиванием и инкубируйте 30 минут при
комнатной температуре. После инкубации пробирку центрифугируйте
при 1500-2000 оборотах в минуту в течение одной минуты. Мягко
покачивая пробирку, отслоите осадок ото дна. При отрицательном
результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную
гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке
видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.
3.3. Реакция агглютинации в микроплате
В лунку 96-ячеечной круглодонной микроплаты внесите 0,05 мл
реагента и 0,05 мл 2% суспензии исследуемых эритроцитов в
физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды
отмойте). Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре
визуально оцените результат реакции по рисунку осадка эритроцитов
на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов
собирается в точку, при положительном - имеет больший диаметр,
располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые
края.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные
D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
5. Форма выпуска
Цоликлон анти-D Супер выпускается в жидкой форме во флаконах
объемом 2, 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве
консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - один год в холодильнике при 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в
закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение
реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным,
протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией
направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению анти-Rho (D) IgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности крови человека
(Цоликлона анти-D Супер)", утвержденную Управлением научных
исследований МЗ и МП РФ 14 июля 1994 года, считать утратившей силу
с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 11
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
I. ВВЕДЕНИЕ
Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным
антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки
человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при
особых условиях.
Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются
введение резус-отрицательному человеку резус-положительной крови
или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным
плодом.
Определение резус-антител наряду с определением
резус-принадлежности больного и донора необходимо для
предупреждения переливания резус-несовместимой крови, а также для
диагностики возможного заболевания плода или новорожденного
гемолитической болезнью.
Определение резус-антител требуется также при подготовке
материла в целях использования для приготовления сывороток
антирезус.
Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С,
анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.
Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов
они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они
реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них
резус-антигены.
Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов,
вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой
среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с
эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта
реакция ничем не проявляется.
Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между
неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные
условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин,
полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса,
реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При
всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и
эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также
проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Разные методы определения резус-антител требуют различных
оптимальных для них температурных условий.
II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных
эритроцитов
Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей
повторными трансфузиями крови или беременностями образуются
антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и
другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке
крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными
эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, C, E, c,
e.
Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись,
то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для
того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.
В качестве контроля на специфичность реакции, а также для
выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные
резус-отрицательные - ccddee эритроциты и, если возможно,
собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.
Такое исследование является предварительным. Для уточнения
специфичности требуются дополнительные специальные исследования
(см. п. IX).
2. Учет формы антител
Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные
антитела; иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме
того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только
полные резус-антитела.
Поэтому определение резус-антител следует производить не менее
чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть
метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим -
любой метод, выявляющий неполные антитела.
III. О ВЫБОРЕ МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
Ниже в п. III, IV, V, VI описаны различные методы исследования
сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см. III), реакция с
применением желатина (см. IV) и реакция с применением полиглюкина
(см. V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может
быть использован любой из них.
Метод исследования сыворотки в солевой среде (см. VI) выявляет
полные резус-антитела и должен обязательно использоваться
одновременно с любым из упомянутых выше.
IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ НЕПОЛНЫХ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1
мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл
изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и
пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и
резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки
доливают доверху изотоническим раствором NaCl, затем содержимое
пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную
жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне
пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для
исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см
с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число
и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации
образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл ) испытуемой
сыворотки.
в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные
эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую
каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой
сывороткой согласно нумерации пробирок.
г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем
встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при
температуре +37ш С. За это время резус-антитела, если они имеются
в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический
раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют,
после чего надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание
эритроцитов повторяют 3-4 раза.
е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам
добавляют 4-7 капель изотонического раствора NaCl для получения 5%
взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются,
интенсивность взвеси контролируют глазом).
ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки
переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со
смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной
капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.
з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной
палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку
слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или
отсутствие агглютинации эритроцитов).
Агглютинация обычно начинается в течение первых 10-30 сек, но
при слабом титре резус-антител может наступить до 20 мин.
3. Трактовка результата
Наличие агглютинации в каплях с образцами резус-положительных
эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными
эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных
резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные резус-антитела - анти-D, С, Е, с и е
- не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2,
1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл)
изотонического раствора NaCl.
в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли
(0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после
перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и
т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В
результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки
от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной
маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус-положительных
эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5
резус-положительных лиц и приготовленных так же, как готовят
стандартные эритроциты.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45
мин в термостат при температуре +37ш С.
е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5%
взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл)
взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну
каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с
эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при
покачивании пластинки.
ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация
(время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных
резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех
разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше
1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и
далее продолжать исследование, как сказано выше.
V. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ
НЕПОЛНЫХ РЕЗУС-АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2-3
дня до исследования в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без
стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы,
группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для
исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской
пипеткой; если при этом захватывается небольшое количество
собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.
Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания
крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание
свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.
Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты
необходимо отмыть изотоническим раствором NaCl.
Для установления титра антител эритроциты готовят ex tempore.
В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10%
раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается
10% взвесь эритроцитов в желатине.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около
10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны
соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми
исследуется сыворотка.
б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной
капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10%
раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина
необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении
или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать
при температуре 4-8ш С желатин не пригоден).
г. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл)
испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их
содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46-48ш С на
15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.
д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5-8 мл
изотонического раствора NaCl. Содержимое пробирок перемешивают
путем одно-двукратного перевертывания их и наблюдают результат в
виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции просматривают на свет.
Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным
глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.
Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью
стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым
увеличением.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами
резус-положительных эритроцитов и отсутствие ее с
резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на
содержание в испытуемой сыворотке неполных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные резус-антитела анти-D, С, Е, а также
с и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2,
1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl.
в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1
мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания
две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей
- в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли
удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток
от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных
резус-положительных эритроцитов или смесь эритроцитов, полученных
от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже,
в виде 10% взвеси в желатине.
д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при
температуре +46-48ш С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на
30 мин.
е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по
5-8 мл изотонического раствора NaCl и наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация,
принимается за титр выявленных неполных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В
этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее
продолжать исследование, как сказано выше.
VI. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ
НЕПОЛНЫХ АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИГЛЮКИНА
(В ПРОБИРКАХ БЕЗ ПОДОГРЕВА)
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-3
дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут
на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность
лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая
кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в
пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая
изотоническим раствором NaCl.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8-10 мл,
которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны
соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми
исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.
в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле
стандартных эритроцитов.
г. Во все пробирки вводят по одной капле 33% раствора
полиглюкина.
д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого,
затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно
поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое
растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой
сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.
е. Через 3-5 минут в пробирки наливают 3-4 мл изотонического
раствора NaCl, осторожно перемешивают содержимое путем 2-3 -
кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают
результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результатов
Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами
резус-положительных эритроцитов и отсутствие ее с
резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на
содержание в исследуемой сыворотке резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е
- не выявлены.
Определение специфичности антител см. п. IX.
VII. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ ПОЛНЫХ
АНТИТЕЛ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в
количестве 1-2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки
вместимостью 8-10 мл, содержащие изотонический раствор
лимоннокислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки
нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята
кровь.
После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический
раствор NaCl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и
отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.
Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках,
взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же
пронумерованных.
Для приготовления 2% взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл
(49 капель) изотонического раствора NaCl и в каждую пробирку в
соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов.
Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2%
взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования
сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой
2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном
округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми
испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом
бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут
порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и
резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
Вместо пробирок можно использовать планшеты для
иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.
б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле
(0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического
раствора NaCl.
Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их
содержимого.
в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению,
вводят по одной (0,05 мл) капле 2% взвеси эритроцитов,
приготовленных в качестве стандартов.
г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают
для инкубации в термостат при +37ш С на один час и затем оставляют
на столе при комнатной температуре на 2-3 часа.
д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и
наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации
эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6-8-кратным
увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки)
(см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови методом
агглютинации в солевой среде").
Наличие агглютинации с резус-положительными образцами
эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными
эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных
резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что полные резус-антитела анти-D, С, Е, а также с
и е не выявлены.
Определение специфичности см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей полные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения
сывороток: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать
планшет для иммунологических реакций.
б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл)
изотонического раствора NaCl.
в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две
капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из
первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй -
в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В
результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05
мл) 2% взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от
4-5 резус-положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как
сказано выше.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет)
помещают в термостат при температуре +37ш С на один час.
е. После инкубации штатив (планшет) вынимают из термостата и
наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация,
принимают за титр выявленных полных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В
таких случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее
продолжать исследование, как сказано выше.
VIII. ФЕНОМЕН ЗОНЫ
При очень высокой степени иммунизации организма образующиеся
резус-антитела иногда дают феномен зоны. Этот феномен заключается
в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной
или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую
положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными
эритроцитами. Однако, если такую сыворотку развести, то при
некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более)
резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную
положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в
методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки
непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее
чувствительности, проба Кумбса является очень ценной реакцией для
выявления неполных резус-антител.
Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в
сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого
испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус-антигену, то
для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку,
взятую в разведениях. Для этого сыворотка разводится и
испытывается, как указано для каждого метода в разделах
"Титрование сыворотки".
Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях
сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в
испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего
исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то
разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная
положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании
применяют изотонический раствор NaCl. Исследование разведенной
сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При
установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной
сыворотки, начиная с 1:2.
IX. СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНТИТЕЛ
Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые"
антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким
антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.
В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие
резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех
образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с
тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D
(наиболее часто встречающиеся), а анти-С или анти-Е.
Положительный результат может также наблюдаться и с
резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы
резус - с, е или антигенов других систем.
Для выяснения специфичности резус-антител необходимо
специальное исследование сыворотки с набором стандартных
эритроцитов, включающих редкие группы ccDee, Ccddee, ccddEe, а
также резус-отрицательные образцы (ccddee), включающие как
содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fy). С
ними же проводится и титрование сыворотки.
X. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно
сделать при положительном результате, полученном любым методом
исследования.
2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно
сделать только при отрицательном результате, полученном при
исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых
является любой метод, выявляющий неполные резус-антитела, а
другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные
резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.
"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/30, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 12
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОАНТИГЕНОВ
ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
1. Введение
Под редкими группами крови понимаются такие сочетания
групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а)
отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б)
отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе активных
и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены, г)
имеются редкие сочетания антигенов разных систем.
Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей,
чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела,
редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации
при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является
редкость или, наоборот, высокая частота антегенов, против которых
могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная
активность некоторых антигенов.
К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки,
содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С,
Е, с, е, Сw, или к одному из антигенов других систем - Келл,
Даффи, Кидд, Левис, Лютеран, MNSs и другие.
К редким сывороткам относятся также полиспецифические
сыворотки, содержащие два или более вида антител, одними из
которых чаще всего бывают антитела анти-D, а другими - антитела
редкой специфичности. К таким редким полиспецифическим сывороткам
относятся сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е,
анти-D+анти-Fyа, анти-D+Келл и другие сочетания антител анти-D с
какими-либо редкими антителами, а также все сочетания только
редких антител, например, анти-С+е, анти-С+анти-Fya и т.д.
Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к
редким группам, повышает возможность образования редких антител,
особенно, если кровь переливалась повторно, и реципиент имел в
прошлом беременности.
Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам,
иммунизированным естественным путем при беременности или
вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность
образования активных редких антител.
Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или
вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с
дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном.
Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких
сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток
антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения
сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Реиммунизация допустима для повышения активности любых
антител, так как не вносит ничего качественно нового в
иммунологический статус иммунизируемого лица и следовательно, не
создает дополнительной опасности в случае необходимости
переливания крови.
Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток
является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.
Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц
допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не
может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в
смысле возможности неблагополучных исходов последующих
беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в
редких сыворотках разной специфичности различна, для получения
таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные
способы.
2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях
Службы крови
Моноспецифические сыворотки антирезус - анти-С, анти-Е,
анти-с, анти-е, анти-Cw, а также моноспецифические сыворотки
других систем применяются наряду с сыворотками анти-D при
фенотипировании крови доноров для создания панели стандартных
эритроцитов и кадров типированных доноров, в том числе доноров
редких групп, а также для установления фенотипа крови больных и
других лиц с целью выяснения причин и предупреждения
сенсибилизации и трансфузионных осложнений.
Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е
применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на
втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом
сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы
одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е
(см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности").
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
других систем, например анти-Fya или анти-Келл, являющиеся главным
образом случайными находками, могут быть использованы при
исследовании крови резус-отрицательных лиц для определения у них
антигенов против которых направлены дополнительные антитела.
3. Источники и способы получения сыворотки
Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е
необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем,
и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.
Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров
добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не
всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток
анти-С.
Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать
только от лиц, сенсибилизированных естественным путем.
Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей
реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном
е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать
резус-положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для
которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в
большинстве случаев резус-положительная кровь.
Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд,
анти-S, анти-s, анти-Сw следует получать от лиц,
сенсибилизированных естественным путем. Поскольку такие антитела
возникают исключительно редко, чаще всего при беременности в
сочетании с многократными трансфузиями крови, то выявление таких
сенсибилизированных лиц, то есть первичный поиск редких антител
следует организовать с привлечением к этой работе отделений
переливания крови при больницах.
После выздоровления этих лиц желательно привлекать к донорству
с последующей реиммунизацией.
Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи, Кидд, S, е,
Cw разрешается только для ограниченного числа доноров в институтах
переливания крови, а также в Центре изосерологических стандартов
при Нижегородской областной станции переливания крови и Станции
переливания крови Комитета здравоохранения г. Москвы.
Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис
могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров,
поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей
врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц,
сенсибилизированных естественным путем - беременностями и
трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с
последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими
антигенами противопоказана.
Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и
анти-Левис производят путем иммунизации животных в учреждениях
судебной медицины.
Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от
лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим
привлечением их к донорству и реиммунизации.
Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и
анти-С+D+E могут быть получены почти исключительно путем
искусственной иммунизации доноров-добровольцев, так как такое
сочетание антител очень редко возникает при естественной
сенсибилизации.
Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+E и анти-C+D+E иногда
образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев
антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с
использованием тех антигенов, против которых требуется повысить
титр антител.
Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой
специфичности могут быть получены от лиц, сенсибилизированных
естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом
на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких
сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови.
Искусственная иммунизация для получения таких сывороток
противопоказана.
4. Методы иммунизации и реиммунизации
Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и
анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".
Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности
следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е
с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны
некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.
Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами
S, s, Cw следует производить аналогично иммунизации антигенами С и
Е. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения
эритроцитов. Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток
анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+E следует производить на фоне уже
имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против
которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена
аналогичны дозам при иммунизации антигенами С и Е. Длительность
курса зависит от срока появления антител.
Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка
по форме, предусмотренной действующей инструкций "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с
указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация
животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р,
анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и
лабораторным регламентам на эти сыворотки.
5. Методы и дозы взятия крови
У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для
последующего получения сыворотки или плазмы (методом
плазмафереза).
Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких
лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора
крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления
стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию
доноров крови".
6. Показатели пригодности редких сывороток для
практического использования
Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать.
Допустим, красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание
вследствие присутствия желчных пигментов.
Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для
практического использования при титре полных или неполных антител
не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких
сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с
титром 1:4.
Сыворотки анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E должны иметь титры
антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр
антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не
ниже 1:16.
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
к антигенам других систем, годны для использования в руках
специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови
при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача
комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при
титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей
редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся
другие антитела с низким титром и слабым авидитетом, то
сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в
руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови.
Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не
подлежит.
7. Организация поиска и первичное исследование сывороток
Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения
сывороток редкой специфичности следует организовать работу по
выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус-отрицательных,
так среди резус-положительных больных и доноров с привлечением к
этой работе лабораторий, в которых проводится определение
резус-принадлежности крови.
Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на
сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая
отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование
сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации,
производится на станциях переливания крови, производящих
иммунизацию.
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или
реакцией конглютинации с применением желатина для выявления
неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для
выявления полных антител.
С целью сокращения объема работы при первичном исследовании
сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно
большего числа антигенов в одном образце; удобнее всего фенотип
CcDEe, K+, Fyа+, Jk+.
В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления
антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5-6
образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов,
считая каждую смесь за один образец.
Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из
осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола
пальца.
При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител
можно производить одновременно с определением
резус-принадлежности, подвергая испытанию сыворотку каждого
исследуемого лица. При этом допустимо предварительно исследовать
сыворотку методом конглютинации с желатином с помощью одного
"стандарта" эритроцитов. В качестве такого стандарта следует
использовать смесь 2-3 образцов резус-положительных эритроцитов
группы О(I), содержащих антигены D, C, E, c, e, Cw, Келл, Fy и
другие.
Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется
далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где
устанавливается специфичность, активность и форма антител.
8. Исследование сывороток на специфичность, активность и
форму антител
Исследование сывороток начинается с проверки групповой
принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на
специфичность, активность и форму антител. Для исследования
применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с
применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде.
Следует иметь в виду, что в одной и той же сыворотке могут
содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их
специфичность может совпадать или быть различной. Так, например,
сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и
анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только
полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть
различен.
Широта исследований зависит от возможности станции переливания
крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми
указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для
дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в
республиканские станции или в институты переливания крови.
Для полного выявления антител, установления их специфичности,
формы и титра следует использовать панель типированных стандартных
эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать
эритроциты группы О(I).
В качестве образцов в панель можно включать эритроциты
типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в
изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты
перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором
хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3
дня, после отмывания - 1 день.
Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с
консервантом, применяемым для консервирования крови, она может
храниться 1 месяц при +4-8ш С. Перед использованием эритроциты
двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок
годности отмытых эритроцитов 1 день.
Более эффективно использование эритроцитов доноров редких
групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах
- 2-5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными
растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы
долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов,
предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты
используются в тот же день.
В панели должны быть представлены стандартные эритроциты,
позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах
следующих систем: Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, MNSs, Лютеран,
Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть
расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так,
чтобы по возможности были включены как положительные, так и
отрицательные образцы для каждого антигена.
Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные
образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных
содержащие пять антигенов системы резус-CcDEe. В этих же образцах
имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем.
Таким образом, положительная реакция с этими образцами укажет на
наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их
специфичности.
Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам
CCDEe, CcDEE, CcDee, CCDee, ссDEe и ccDEE. Часть их гомозиготна, а
часть гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для
идентификации антител анти-с и анти-е.
Затем следуют образцы фенотипов ccDee, Ccddde и cccdEe. Эти
образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе
резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием
антигена С (фенотип ССdee). Этот образец дает возможность
идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например,
анти-D+анти-с.
Среди резус-положительных образцов в панели должны быть
разновидности с содержанием антигена Du и антигена Cw. Образец Du
служит для того, чтобы установить достаточно ли активны антитела
анти-D. Образец с содержанием антигена Cw служит для выявления
антител анти-Cw.
Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная
реакция с которыми указывает на наличие антител по другим
системам. Эти образцы содержат разнообразные сочетания антигенов
других систем: положительные и отрицательные по антигенам Fya, Fyb
и Кидд.
Необходимы Келл-положительные образцы. Некоторые из них
чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащие второго аллеля этой
системы, т.е. Челлано-отрицательные. Келл-положительные образцы
подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них
антигенов Даффи.
Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить
специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как
антитела анти-Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте
после антител антирезус.
Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает
различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами
этой системы - Jka-; Jkb-; Lea+; Leb-.
И, наконец, в панели представлены фенотипы по другим системам
MNSs, P, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия
по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.
Использование представленной панели стандартных эритроцитов
дает возможность выявлять и определять специфичность полных и
неполных антител всех серологических систем как в том случае,
когда эти антитела одной специфичности, так и в том, когда
антитела различаются и по специфичности, и по форме.
В практической работе исследование следует начинать следующим
порядком: сначала используются выборочно 10-12 образцов
эритроцитов, подобранных с таким расчетом, чтобы выявить
сенсибилизацию к любому из основных антигенов резус - D, C, E, c,
e, Cw. Среди резус-отрицательных включаются образцы также с
максимальным набором различных других антигенов.
Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной
специфичности или их сочетание, то агглютинация наступает также с
соответствующими образцами эритроцитов.
Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы,
имеющие антигены Fy или Келл, то следует произвести дополнительные
исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа
по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует
резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fy и Келл,
то панель для исследования следует еще более расширить с
включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд,
Левис, MNSs и т.д.
Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для
первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то
проводятся дополнительные исследования с использованием
стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих
антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами
свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и
анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует
иметь в виду другие, широко распространенные антигены, например,
Челлано и поэтому использовать Челлано-отрицательные стандарты. В
случае положительного результата и с этим стандартом следует
расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных
по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить
наличие в сыворотке нескольких антител.
Титрование сыворотки. После выявления антител и установления
их специфичности и формы следует определить титр антител.
Титрование проводится отдельно для неполных и полных антител
непрямой пробой Кумбса, в методе конглютинации с желатином и
реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию
сывороток антирезус (см. инструкцию "По исследованию сывороток на
наличие резус-антител"). Для титрования используются образцы
эритроцитов, содержащие антиген, против которого направлены
антитела. По возможности титрование проводится с гомозиготными и
гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является
обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом
дозы и будучи активными с гомозиготными образцами (сс) могут
оказаться неактивными и дать ложноотрицательный результат при
исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о
возможности практического использования таких сывороток
учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается
на этикетке.
Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки дает
возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в
сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая
сыворотка, имеющаяся в достаточном количестве, для дальнейшего ее
использования должна быть обработана и расфасована, как указано в
пункте 10. Расфасованные сыворотки хранятся в течение 3 недель,
после чего проводится их стандартизация.
9. Стандартизация сыворотки
Стандартизация редких сывороток производится на областных
станциях переливания крови, располагающих необходимыми
стандартами, или на станциях и в институтах переливания крови. При
стандартизации производятся исследования, предусмотренные в
параграфе 8. Результаты сопоставляются с данными, указанными на
этикетке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки
флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.
При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой
специфичности, формы и титра антитела содержатся в данной
сыворотке и для определения какого (каких) антигенов и в какой
именно реакции пригодна данная сыворотка.
Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в
пункте 6, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже
требуемого и при этом правильно оформлены этикетки и наставление
по использованию, то учреждение, проводившее стандартизацию, дает
заключение о возможности использования данной сыворотки как
стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение,
представившее сыворотку для стандартизации.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в
учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с
указанием причин непригодности сыворотки или неправильности,
имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по
возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае затруднений проведения стандартизации (наличие
каких-либо неизвестных антител и т.п.) редкие сыворотки
могут направляться в Центр по изучению и стандартизации групп
крови в ГНЦ РАМН.
Центр по изучению и стандартизации групп крови производит
также выборочный контроль редких сывороток, изготавливаемых в
учреждениях Службы крови страны.
10. Обработка и расфасовка сыворотки
После того, как у сенсибилизированного лица при первичном
исследовании его сыворотки выявлены редкие антитела, от него
получают сыворотку или плазму (методом плазмафереза). Сыворотку
консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл
сыворотки или азида натрия 1 г на 1000 мл. К плазме для удаления
фибрина добавляют 10% раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на
100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в
другой флакон и так же консервируют.
На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием
фамилии, и.о. донора, групповой принадлежности по системе АВО и
характеристики изоиммунных антител с теми подробностями, которые
удалось выявить при первичном исследовании. Через два-три дня
(можно несколько позже) сыворотку вновь исследуют на наличие,
специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 8.
Результат исследования записывают на этикетке сосуда с сывороткой
и регистрируют в журнале.
Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется
возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое
количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как
сказано выше. Флаконы с сывороткой хранят при +4-8ш С.
Если показатели специфичности и активности (титра) антител и
внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 6,
сыворотку можно считать пригодной для практического использования
и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в
зависимости от предполагаемых объемов использования. Чем большая
редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки
сыворотки.
Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.
Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется
специфичность, форма и активность антител, проверяется
правильность паспортизации и решается вопрос о возможности
использования этой сыворотки и методе, рекомендуемом для
практической работы.
Для удаления антител системы АВО сыворотки рекомендуется
абсорбировать. Абсорбция проводится эритроцитами соответствующей
групповой принадлежности с отсутствием в них антигена, против
которого в сыворотке имеются изоиммунные антитела. Абсорбция или
нейтрализация антител альфа и бета проводится после исследования
сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до
ее расфасовки.
После абсорбции и еще через три недели сыворотку исследуют на
наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и
титр изоиммунных антител. Если групповые антитела альфа и бета
исчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям,
указанным в пункте 6, сыворотку можно расфасовать.
11. Паспортизация сыворотки
На ампулы (флаконы) с расфасованной сывороткой наклеивают
этикетки, на которых указывают: название учреждения и город, где
изготовлена сыворотка, номер серии (или символ, избранный для ее
обозначения), например, сокращенная фамилия донора,
специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Указывается
также групповая принадлежность по системе АВО. Для сыворотки
группы АВ(IV) или, специально абсорбированной, вместо символа,
обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова "для всех
групп крови". На этикетках наносятся по диагонали цветные полосы:
для группы А(II) - две синие, для группы B(III) - три красные, для
сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые.
На этикетках указывается количество, срок годности и условия
хранения.
ПРИМЕРЫ НАСТАВЛЕНИЙ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК
+-----------------------------------------------------------------+
| СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ |
+-----------------------------------------------------------------+
| Стандартная сыворотка для определения |
| антигенов эритроцитов |
| методом конглютинации с желатином в пробирках |
| |
| Метод использования: |
| |
|1. В пробирку к одной капле сыворотки (0,05 мл) добавить одну|
| каплю испытуемых эритроцитов (0,05 мл) и 2 капли желатина (0,1|
| мл). Содержимое перемешать путем встряхивания. |
| |
|2. Инкубировать в термостате при +48 - +50ш С в течение 30 минут|
| или в водяной бане при +48 - +50ш С в течение 15 минут. |
| |
|3. После прогревания в пробирку долить 8-10 мл физиологического|
| раствора, содержимое перемешать путем перевертывания пробирки.|
| |
|4. Учесть результат реакции. |
| |
| Во всех сомнительных случаях результат оценить путем микроско-|
| пирования. |
| |
| Серия 85 анти- Е для всех групп крови |
| ------- ---- ----- |
+-----------------------------------------------------------------+
+-----------------------------------------------------------------+
| СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ |
+-----------------------------------------------------------------+
| Стандартная сыворотка для определения |
| антигенов эритроцитов |
| в методе солевой агглютинации |
| (в маленьких пробирках или на планшетах) |
| |
| Метод использования: |
| |
|1. Приготовить 2% взвесь эритроцитов дважды отмытых изотоническим|
| раствором хлорида натрия. |
| |
|2. К одной капле тест-сыворотки добавить одну каплю исследуемой|
| взвеси эритроцитов. |
| |
|3. Инкубировать пробирки (планшеты) 1 час при температуре 37ш С. |
| |
|4. Учесть результаты реакции с помощью лупы. |
| |
| Серия 52 анти- С для всех групп крови |
| ------ ---- ----- |
+-----------------------------------------------------------------+
12. Хранение и выдача сыворотки
Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном
состоянии при температуре не выше -15ш С или при +4- 8шС.
Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд
учреждений, в которых они изготовлены и могут выдаваться в другие
учреждения Службы крови.
При выдаче сыворотки к ней прилагают наставление по
использованию, в котором указывают, в каком методе для каждого из
антител следует использовать данную сыворотку.
При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в
целях экономии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок
годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии -
один год, при хранении в условиях +4-8ш С - четыре месяца. По
истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не
снизился или снизился не более чем на два разведения и при этом
сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок
продляют еще на два месяца. Если через два месяца титр также
сохранился - срок снова продляется.
"Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп,
предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов
человека", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 26
марта 1979 года N 06-14/3, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 13
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-С МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА С СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-С СУПЕР)
ТУ 9398-207-27575295-94
1. Назначение
Цоликлон анти-С Супер предназначен для выявления антигена С
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-С сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-С антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-С
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-С Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию С+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена С
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена С
Цоликлон анти-С Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена С производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На предварительно подогретую (35-40ш С) пластинку
нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну
маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02-0,05 мл) и
смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-С и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37ш
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные С+ и
С- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-С Супер - один год при
температуре 2-8ш С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8ш С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-rh' (С)
моноклонального для определения антигена С системы резус на
эритроцитах человека (Цоликлон анти-С Супер)", утвержденную
Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта
1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 14
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-Е МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА E СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-E СУПЕР)
1. Назначение
Цоликлон анти-E Супер предназначен для выявления антигена E
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-E сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-Е антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-Е
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-Е Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию Е+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена Е
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена Е
Цоликлон анти-Е Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена Е производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На пластинку нанести одну большую каплю реагента
(примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или
эритроцитов (0,02-0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-Е и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37ш
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные Е+ и
Е- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-Е Супер - один год при
температуре 2-8ш С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8ш С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 15
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ ПОСТРАНСФУЗИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ,
ОБУСЛОВЛЕННЫХ ФАКТОРАМИ КЕLL И C(HR')
Наиболее выраженными антигенными свойствами среди минорных
антигенов эритроцитов обладают факторы Kell (K) и с. Фактор К
стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно
опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.
--------------------------------
<*> - Составители: С.И.Донсков, А.Г.Башлай, Т.М.Пискунова,
В.И.Червяков, И.С.Липатова.
Индекс сенсибилизации (процент лиц с повышенным риском
посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам
высокий.
Фактор К встречается примерно у 10% людей, поэтому почти
каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной
крови К-отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность -
это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом.
С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору
К, необходимо выдавать в лечебные учреждения К-отрицательные
эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях переливания крови
следует производить определение К фактора у всех доноров в
обязательном порядке наряду с определением групповой- и
резус-принадлежности крови, после чего отбирать К-положительные
образцы, не допуская их выдачи для переливания К-отрицательным
больным.
К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид
донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не
эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить
индекс сенсибилизации населения к фактору К, что в свою очередь
будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений,
обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической
болезни новорожденных.
Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью
следующих методов:
1. Непрямая проба Кумбса.
2. Желатиновый метод в пробирках.
3. Экспресс-метод на плоскости.
Индекс сенсибилизации населения к фактору с так же достаточно
высок. Около 20% людей не содержат антигена С в эритроцитах.
Именно эти люди представляют группу повышенного риска развития
посттрансфузионного осложнения, поскольку им в 80% случаев
переливают эритроциты, содержащие фактор с. Число переливаний
с-положительных эритроцитов с-отрицательным реципиентам составляет
16 на 100 гемотрансфузий. Число беременностей с-положительным
плодом с-отрицательных женщин составляют также 16 на 100.
С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и
избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных
несовместимостью по этому фактору, целесообразно у каждого
резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его
отсутствии переливать реципиенту кровь доноров с-отрицательных
(гомозиготных по антигену С). На станциях и в отделениях
переливания крови необходимо иметь резервную группу таких доноров
или запас с-отрицательной эритроцитной массы.
Антиген с определяют теми же методами, что и антиген D.
Инструкция
по определению Келл-фактора экспресс-методом
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К
универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с
гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы.
Для исследования используют свежие - не более 2-х дневного
хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки
после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов),
плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют
также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно
перед исследованием.
Техника определения: на плоскость помещают одну каплю (0,05
-0,06 мл)<*> сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3
от объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой
и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за
ходом реакции в течение 5 минут.
--------------------------------
<*> - 1 мл сыворотки анти-К расходуется на 15-20 исследований.
Оценка результатов: при положительном результате агглютинация
эритроцитов появляется к 30 сек - 1 мин и в дальнейшем
усиливается, при отрицательном результате агглютинация
отсутствует. По истечении 3-4 минут в реагирующую смесь добавляют
1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной
неспецифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до
истечения 5 минут, после чего регистрируют результат (см. рис.)<*>
--------------------------------
<*> - рисунок не приводится.
ВНИМАНИЕ! Во избежание ошибок рекомендуется использовать
осадок эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей
среды.
Срок годности сывороток - четыре месяца.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 16
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИММУНИЗАЦИИ ДОНОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ
И ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРЕЗУС
1. Выбор доноров для иммунизации
К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться
доноры-мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или
моложе, если у них уже наступила менопауза.
Реиммунизация может производиться лицам, ранее
сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных
беременностей или введения им крови.
Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления
с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц и с их
согласия, данного в письменной форме.
Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и
сенсибилизированные лица, привлеченные к донорству, проходят
врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому
освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29
мая 1995 года.
Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщины
выкидышей, мертворождений, гемолитической болезни у их
новорожденных и другой патологии, связанной с резус-конфликтом, не
является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и
последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого
контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее
120 г/л, количества эритроцитов - не менее 3,7 х 10 12/л,
лейкоцитов до 10х10 9/л, палочкоядерных нейтрофилов до 10%,
лимфоцитов до 45%.
У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию,
проводят исследования на антиген гепатита В, антитела к вирусу
иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание
аланинаминотрасферазы. Эти исследования повторяют перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации.
К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови антигена
гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека
(ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы.
Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь
которых будет использована в качестве антигена, титруют по
антигенам системы резус: D, C, E, c, e и по возможности других
систем (Келл, Даффи и т.д.).
До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие
различных резус-антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса.
Положительный результат прямой пробы Кумбса является
противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и
вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител
устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают
возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или
иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител
такому лицу можно проводить реиммунизацию.
После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана
справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае
необходимости гемотрансфузии.
Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге,
отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный
влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие
сведения:
- город и название учреждения, производившего иммунизацию и
выдавшего справку,
- фамилия, имя, отчество донора,
- группа крови по системе АВО;
- резус-принадлежность (фенотип);
- чем иммунизировали (резус-антиген);
- при необходимости гемотрансфузий обязателен индивидуальный
подбор совместимой крови только от резус ........ лиц.
Справка должна быть подписана руководителем учреждения с
указанием даты и скреплена печатью.
2. Подготовка донора, кровь которого
используется в качестве антигена
Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты
консервированной крови активных доноров группы О(I) или
одноименной с кровью иммунизируемого лица.
Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров,
дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть
обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения
латентно протекающего заболевания печени.
Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против
которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен
отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью.
Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти
человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же
донора.
Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается
стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и
годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем
прокола пробки кровь должна быть использована сразу для
иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после
вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается.
Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные
размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для
этой среды.
Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой
активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по
быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с
антисывороткой соответствующей специфичности.
При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется
для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и
того же донора, преимущественно свежеконсервированные.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в
специально отведенном помещении, в котором не производится работа
с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными
лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией
проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков.
Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при
отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.
Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса
иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на
наличие, специфичность и активность антител.
Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров
антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах
могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения
антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев
между курсами, и в дозах - в пределах+-5 мл.
При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь,
используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна
быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц
фенотипа ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа
ccDee. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой
иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела
анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц
фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа
ccDee, а также фенотипа CcDee.
Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа
CCddee кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду
возможности образования у них антител анти-с.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови,
последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними
три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс
иммунизации.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по
три-четыре дня.
Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не
выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса
следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные
второму курсу.
Если после четвертого курса у донора не выработается антител,
через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами, следует
провести сокращенные курсы по типу реиммунизации.
Если и после такой длительной иммунизации антитела не
образуются, донора от иммунизации отстраняют.
После выработки у донора активных антител для сохранения и
дальнейшего повышения их титра им необходимо периодически
проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизация доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались
антитела-D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее
беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает
возможность сохранить титр антитела в крови иммунизируемых лиц или
добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации
проводится так же, как и для иммунизации.
Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания
иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре
месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями
крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре
месяца, но только вне периода беременности и лактации.
Курс реиммунизации состоит из
двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови
донора по 2-3 мл с интервалом два-три дня. Такие курсы повторяются
каждые четыре месяца.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от
четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр
антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры
анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются
не ранее, чем через полтора года.
Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают
выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее,
чем у 70% иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие
сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов,
применяемых для иммунизации:
+------------+----------------------+----------------------------+
|Планируемые | Фенотип крови | Фенотип эритроцитов, |
| антитела | иммунизируемого лица | применяемых для иммунизации|
+------------+----------------------+-----------------+----------+
| | ccddee | Ccddee | CCddee |
| +----------------------+-----------------+----------+
| анти-С | ccDee | Ccddee | CCddee |
| | ccDEe | CcDee | CCDee |
| | | CcDEe | CCDEe |
+------------+----------------------+-----------------+----------+
| | ccddee | ccddEe | |
| анти-Е | Ccddee | | |
| +----------------------+-----------------+----------+
| | CcDee | ccddEe | ccDEE |
| | | ccDEe | CcDEE |
| | | CcDEe | |
+------------+----------------------+-----------------+----------+
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы
иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови
донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по
2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре
месяца.
Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных
введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по
1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный
второму, и так повторяют каждые четыре месяца.
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных
инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция -
10 мл и последующие пять - 5 мл. Через восемь - десять месяцев
проводится второй курс.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови по 5 мл с интервалами по три-четыре дня.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный
второму, и так повторяется каждые четыре месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев
(полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации.
Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8
для неполных антител и 1:2 - 1:32 для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного
влияния на состояние здоровья доноров.
В процессе иммунизации, а также после выработки антител при
взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться
преходящие изменения периферической крови, например, увеличение
количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов до 12%,
лимфоцитов до 45%, повышение содержания общего количества
лейкоцитов до 10х10 в степ. 9 /л, общего билирубина до 20,5
мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей,
пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при
37ш С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения
иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы
(плазмаферез).
Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц,
обработка сывороток и их испытание производятся согласно
действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".
Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится
по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства
здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов
Российской Федерации.
Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы
(плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к
неиммунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам
Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения
субъектов Российской Федерации.
С целью увеличения количества изоиммунных доноров крови,
плазмы разрешается дополнительная оплата изоиммунным донорам за
дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления
здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Изоиммунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в
лечебных учреждениях.
Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения
сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/138, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 17
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ВЗЯТИЮ И УЧЕТУ КРОВИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ОТ
ДОНОРОВ МАЛЫМИ ДОЗАМИ, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в
других лечебно-профилактических учреждениях, где производится
определение резус-принадлежности и изготовление сывороток
антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров,
у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.
Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при
определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении
антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении
стандартных сывороток, предназначенных для определения группы
крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для
выявления антигенов эритроцитов.
1.1. При определении группы крови необходимо иметь контрольные
эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В;
1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих
сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте
1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2;
1.3. при определении резус-принадлежности необходимы
контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты;
1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при
выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты
доноров, указанных в пункте "в", и дополнительно подобрать доноров
групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному
резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти
доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от
наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть
пополнено за счет доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах
доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, C, E, c,
e, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем
К - k, Fya - Fyb и других систем эритроцитов;
1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности
необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в
пунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных
эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и
отрицательные по различным антигенам.
2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у
доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в
зависимости от потребности.
3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете
отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен
донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь
малыми дозами, не входит в состав учреждения Службы крови, донор
находится на учете непосредственно в этой лаборатории.
При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца)
донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется
содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови
допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г% (120
г/л) для женщин и 13 г% (130 г/л) - для мужчин.
4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления
стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия
крови по следующей форме:
Фамилия ______________ имя _____________отчество _____________
Группа крови _________________________,
фенотип по различным системам эритроцитов ____________________
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
| 1. Дата |1. Количество|1. Расписка |1. Расписка лица,| 1. Расписка лица,|
|взятия крови| взятой крови|донора, давшего| взявшего кровь | использовавшего |
| | | кровь | | кровь для работы |
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
| 2. |2. |2. |2. | 2. |
| | | | | |
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 месяца.
Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд
которого бралась кровь.
6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в
книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен
указать количество взятой крови и за какой период времени взята
кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.
7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры
взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь
устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации,
установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.
8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все
льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным,
согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и
органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной
день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве
не менее 100 мл.
"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976
года N 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 18
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ
ГРУППОВОЙ СИСТЕМЫ АВО
I. ВВЕДЕНИЕ
Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными
(естественными) у человека. Они относятся к полным антителам -
агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются
при комнатной температуре и хуже при температуре 37ш С. Добавление
в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител,
непрямой пробой Кумбса их не выявляют.
Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из
сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они
чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при
70ш С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела
полностью потеряли активность.
Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у
человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы,
которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и
анти-В.
Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но
могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном
поступлении в организм несовместимого в групповом отношении
антигена, при иногруппной беременности, при ошибочном переливании
крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении
некоторых прививок и иммунизации.
При иногруппной беременности, послужившей причиной
гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В
почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения
больного ребенка. При этом им обычно сопутствует высокий титр
нормальных антител альфа и бета.
При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные
антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый-седьмой
день, достигая максимума к пятнадцатому-двадцать пятому дню с
последующим падением их титра.
В крови у таких больных одновременно повышается титр
нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с
последующим снижением после 25-30 дня.
Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной, так
и неполной форме. Они активны при 37ш С, могут иметь несколько
более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по
сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные
антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической
субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и
сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут
при температуре 70ш С, т.е. при условиях, при которых нормальные
антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление
изоиммунных антител может служить ценным диагностическим
признаком, в частности, при решении вопроса о причинах
гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни
новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в
практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител
альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти-В является их
поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и
основано применение разных методов для выявления нормальных
антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см.
разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде
способности вызывать агглютинацию эритроцитов при проведении
реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой
пробе Кумбса.
Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же
причинами, могут одновременно образовываться гемолизины, которым
свойственна также групповая специфичность (Методы определения
групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).
II. ОСНАЩЕНИЕ
При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А,
анти-В необходимо следующее оснащение:
- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь
эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;
- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки центрифужные;
- пробирки маленькие высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром
5-6 мм и с гладким дном округлой формы;
- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;
- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
- штативы;
- термостат 37ш С;
- центрифуга;
- водяная баня 70ш С.
III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНЫХ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
РЕАКЦИЕЙ СОЛЕВОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl путем
центрифугирования, после чего на дне пробирки остается
эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и
отдельно каждой группы.
Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре
раза изотоническим раствором NaCl во избежание коагуляции при
нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из
которых прогревают в течение 10 минут при 70ш С, точно соблюдая
температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки
- нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.
Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой
среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных
антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой
пробой Кумбса.
2. Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив
устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании
сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив
предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают
отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и
группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови
стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения
помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).
Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по
две капли изотонического раствора NaCl. Затем в первую и во вторую
пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной
непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.
Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с
изотоническим раствором NaCl и две капли этой смеси переносят в
третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в
четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В
результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до
1:8000.
В другом штативе также приготавливают разведения
предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно
достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от
1:4 до 1:128).
После приготовления разведений сыворотки во все пробирки
добавляют по одной капле 2-3% взвеси стандартных эритроцитов
противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) -
эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) -
эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы О(I)
в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой
ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы
оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной
температуре, с прогретой - при 37ш С.
3. Трактовка результатов.
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне
пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением
над источником света.
При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков
неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь
краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов
располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде
правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у
каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных
антител, а последнее разведение, в котором она наблюдается - об их
титре.
Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к
агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке
- к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если
агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить
исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках с прогретой
сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕПОЛНЫХ ИЗОИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl, после чего на
дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для
исследования.
2.Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В (III) в штатив
устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) -
два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно
накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для
установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой
пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для
реакции солевой агглютинации.
Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли
изотонического раствора NaCl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по
три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее
приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода
солевой агглютинации, но в объеме трех капель.
Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной
маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы,
смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помещают для инкубации
в термостат на 45 минут при 37ш С. За это время иммунные антитела,
если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки
доливают изотонический раствор NaCl, перемешивают их содержимое и
центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание
повторяют три раза.
После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель
изотонического раствора NaCl для получения приблизительно 5%
взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой
взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью,
пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно
номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле
сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой.
Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом
покачивании пластинки.
Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации,
видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление
агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс
(+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах.
Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных
антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение,
в котором оно наблюдается - об их титре<*>.
--------------------------------
<*> - Контроль в отношении возможного ложно-положительного
результата за счет активных полных антител не требуется, т.к. в
данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только
при отрицательном результате в солевой среде.
В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках,
следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об
отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции
исследуемой сыворотки.
3. Трактовка результатов.
В ходе вышеописанного исследования определяются три вида
антител:
- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета
(термолабильные);
- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные);
- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В
(термостабильные).
Общее заключение делается на основании сопоставления
результатов всех исследований:
а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или
неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в
организм человека антигена, несовместимых полных (термолабильных)
антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 -
для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных
антител;
б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа
и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном
методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных
антител в момент исследования, отражает состояние повышенной
сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о
бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого
по системе АВО;
в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В
при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не
выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об
отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы
АВО к моменту данного исследования.
V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИЗИНОВ СИСТЕМЫ АВО
1. Оснащение,
- стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III);
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки вместимостью 8-10 мл;
- маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см;
- штативы;
- термостат 37ш С;
- центрифуга.
2. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также
эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоническим
раствором NaCl путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь
в изотоническом растворе NaCl.
Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не
более 48 часов при температуре 4-8ш С.
В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью
8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом
растворе NaCl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.
3. Техника реакции.
В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда
при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда
- при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют
одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с
исходными разведениями сыворотки.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором
накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают
фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу
крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в
пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят
соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так,
чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4
и т.д. до 1:32.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5% взвеси
эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты
лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также
контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят
эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если
исследуется сыворотка группы А(II), или группы А(II), если
исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки
группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в
четвертый ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания
и штатив помещают на 45 минут при температуре 37 шС, затем
пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат
невооруженным глазом в проходящем свете.
4. Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие
групповых гемолизинов анти-А и анти-В.
Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся
эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности
окрашивания надосадочной жидкости:
- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а
надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые
гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),
- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочная
жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности
(иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это
значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые
гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от
одного плюса (+) до трех плюсов (+++)),
- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена
в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой
сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на
четыре плюса (++++).
Результаты учитываются как истинные, т.е. относящиеся к
гемолизинам анти-А и анти-В, только при отсутствии гемолиза в двух
контрольных рядах.
При наличии гемолиза не только с эритроцитами противоположной
группы, но и в контрольных рядах - исследование повторяют. При
подтверждении результатов реакции следует решать вопрос о природе
обнаруженных гемолизинов, с учетом характера заболевания и других
показателей.
Методические рекомендации "Определение иммунных антител
групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения
СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/135, считать утратившими силу с
момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 19
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ
ЭРИТРОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЮ В
ИЗОСЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания
аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных
антител в сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови
АВО перекрестным способом, при определении резус-принадлежности
крови, а также для проведения контроля специфичности и активности
стандартных изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток
антирезус; тест-сывороток и реактивов, предназначенных для
определения антигенов различных систем эритроцитов крови человека.
Стандартные эритроциты группы О(I) должны содержать в эритроцитах
клинически значимые антигены: D, C, Cw, c, E, e, K, k, Fy, Jk, M,
N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов
можно производить их консервирование специально изготовленными
консервирующими растворами.
I. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИТАМ
Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны
давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со
стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать
агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного
антигена эритроцитов.
Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для
выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64,
эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления
агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.
Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных
изогемагглютинирующих сывороток группы Абета(II) (анти-В) и
Вальфа(III) (анти-А) или соответствующих моноклональных антител,
удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.
Время наступления агглютинации эритроцитов А1 и В со
стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять
не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А3, В2 - не более
двух минут.
Стандартные эритроциты группы крови О(I) не должны давать
агглютинации со стандартными сыворотками групп крови Оальфа
бета(I), Абета(II), Вальфа(III) в течение двадцати минут.
Стандартные резус-положительные эритроциты группы крови О(I),
содержащие антиген D, а также антигены С, Cw, c и E, e в различных
сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы резус,
должны давать соответственно со стандартными сыворотками анти-D,
анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е и анти-е четкую агглютинацию при
определении методом конглютинации с желатином, экспресс-методом
в пробирках или на плоскости без подогрева или непрямой пробе
Кумбса в зависимости от того, для какого метода исследования
предназначена данная стандартная сыворотка антирезус.
Стандартные резус-отрицательные эритроциты О(I) фенотипа
ccddee не должны давать агглютинации с реактивами антирезус,
содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах
исследования, для использования в которых предназначены указанные
реактивы антирезус.
Время наблюдения за отрицательной реакцией должно
соответствовать времени, установленному для каждой из этих
реакций.
II. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Приготовление стандартных эритроцитов производится в условиях
строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления
консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в
консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции
и контрольных исследований.
1. Изготовление консервирующего раствора для стандартных
эритроцитов.
Консервирующей средой для приготовления стандартных
эритроцитов могут служить растворы следующего состава:
Консервант N 1:
сорбит 40,0 г
глюкоза 6,0 г
Na2HPO4х12H20 2,0 г
KH2PO4 0,9 г
левомицетин 0,06 г
этиловый спирт 96ш 100 мл
вода бидистиллированная до 1000 мл
рН раствора 6,8-6,9
В случае необходимости доведения рН до требуемой величины
добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или
Na2HPO4х12H20.
Консервант N 2:
аденин 0,03 г
инозин 0,06 г
лимонная кислота 1,5 г
глюкоза 3,0 г
Na3PO4 0,4 г
NaOH 1н 20 мл
вода дистиллированная до 100 мл
рН раствора 6,3-6,4
Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой
прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизация
консервантов производится путем фильтрования их через
соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в
стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно
закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими
колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае
помутнения консервирующего раствора или появления желтого
окрашивания применение его для работы недопустимо.
2. Получение взвеси эритроцитов в консерванте
Источником получения стандартных эритроцитов является
эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из
консервированной крови доноров. Кровь берут от доноров, фенотип
эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных
эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного
материала должна быть использована эритроцитная масса от одного
специально отобранного донора.
А для получения стандартных эритроцитов других систем можно
использовать смесь эритроцитов группы О(I) от нескольких (2-4)
доноров различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких
антигенов: К, Сw, Е присутствовали в эритроцитах не менее чем у
двух доноров. Используется эритроцитная масса, полученная не
позднее 2-3 суток от момента заготовки крови.
В боксе через стерильную систему путем прокола переливают
эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так,
чтобы соотношение эритромассы и консервантов было 1:4. Содержимое
флакона острожно перемешивают и разливают той же системой в
стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему
для взятия.
Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками,
завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют
(см. п. 3) и помещают в рефрижератор при температуре +4ш С.
3. Маркировка
На флаконы со стандартными эритроцитами наклеивают этикетки с
указанием: учреждения, изготовившего эритроциты, группы крови по
системе АВО, антигенного состава эритроцитов, срока годности.
Наставление по применению стандартных эритроцитов прилагается при
выдаче (см. п. IV).
4. Контроль
Контроль специфичности и активности стандартных эритроцитов
производится после их расфасовки и маркировки в
изоиммуннологической лаборатории станции переливания крови.
5. Хранение и сроки годности
Стандартные консервированные эритроциты хранят при +4ш С. Срок
годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца.
При использовании в качестве стандартных эритроцитов цельной
консервированной крови, а также эритроцитной массы в комбинации с
другими гемоконсервантами, срок хранения стандартов 1-4 недели.
III. ТРАНСПОРТИРОВКА СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Транспортировка стандартных эритроцитов производится
аналогично транспортировке консервированной крови в изотермической
таре.
IV. НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
(прилагается при выдаче)
Консервированные стандартные эритроциты используют в
постановках реакций в различных методиках в соответствии с
действующими инструкциями по изосерологии.
1. Стандартные эритроциты группы О(I) с содержанием в
эритроцитах клинически значимых антигенов D, C, Cw, c, E, e, K, k,
Fy, Jk, M, N, S, s, Le предназначены для выявления соответствующих
изоиммунных противоэритроцитарных антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине, непрямой пробе Кумбса, реакции агглютинации в солевой
среде в пробирках или на плоскости.
Для желатинового метода используют осадок стандартных
эритроцитов или 10% их взвесь в желатине для чего к одной части
осадка эритроцитов добавляют девять частей 10% раствора желатина,
стандартизованного для серологических исследований. В реакции
используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных
эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на
следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и
реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные
эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором
хлористого натрия.
2. Стандартные эритроциты группы О(I), А1(II), А2(II), В(III)
предназначены для выявления изогемагглютининов альфа и бета в
сыворотке или плазме крови при определении групповой
принадлежности крови перекрестным методом, а также для выявления
неполных изоиммунных альфа и бета антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине и непрямой пробе Кумбса. Для перекрестного метода и
реакции конглютинации в желатине применяют неотмытые стандартные
эритроциты взятые непосредственно из осадка со дна флакона. Для
желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или
10% их взвесь в желатине для чего к одной части осадка эритроцитов
добавляют девять частей 10% раствора желатина, стандартизованного
для серологических исследований. В реакции используют по две капли
(0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине
используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую
порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой
среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз
физиологическим раствором хлористого натрия.
3. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов -
два месяца.
Стандартные эритроциты из разгерметизированного флакона
пригодны для использования в течение недели.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Медицинское законодательство
Приложение N 6
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО УДАЛЕНИЮ ИЗ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИТЕЛ ДРУГОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ
Общие сведения
В практической работе по определению резус-принадлежности
крови наибольшее удобство представляет использование сывороток
антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых
агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются
универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность
в крови любой группы по системе АВО.
Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и
В(III), также могут быть превращены в универсальные путем
абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и
бета.
Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки
антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные
антитела другой специфичности, чаще всего анти-С и анти-Е. Если
эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи
абсорбции или путем разведения сыворотки.
Использование универсальных сывороток антирезус упрощает
работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает
получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы
сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов.
Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа,
бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:
а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической
жидкости (см. п. 1);
б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета
естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского)
(см. п. 2);
в) абсорбцию групповых агглютининов альфа и бета
резус-отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови
после снятия с них сыворотки (см. п. 3);
г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем
разведения сыворотки (см. п. 4);
д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой
специфичности (см. п. 5);
е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения
сыворотки (см. п. 6).
1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощи
амниотической жидкости<*>
Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую
субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть
использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная
и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку
амниотической жидкости см. п. 8).
--------------------------------
<*> - Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgМ, неполные альфа и бета
антитела, относящиеся к классу lgG, при этом не нейтрализуются.
Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке
антирезус группы Оальфа бета(I) используют амниотическую жидкость
группы АВ(IV) или смесь образцов амниотической жидкости групп
А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке
группы Абета(II) используют амниотическую жидкость группы В(III).
Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы
Вальфа(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).
Для полного истощения групповых агглютининов в исходной
сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для
чего:
- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, во все пробирки вносят по 2 капли
амниотической жидкости - нативной или растворенной после
высушивания;
- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой
сыворотки, во вторую 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую -
10 капель, в пятую - 12 капель;
- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при
комнатной температуре;
- после 10-минутной экспозиции смесь из каждой пробирки
контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими
антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;
- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация
(время наблюдения 5 минут), принимается за оптимальное соотношение
амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;
- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят
разведения 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано
выше;
- после того, как выбрано оптимальное соотношение, к основному
объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество
амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 минут после
перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на
плоскости с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы
А(II) и В(III);
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Примечание:
В целях упрощения получения универсальных сывороток из
сывороток антирезус группы Абета(II) и Вальфа(III) их можно
предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать
одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью
группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и
группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки
противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом
происходит частичная взаимная нейтрализация групповых
агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости,
необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается
степень разведения абсорбируемой сыворотки.
Использование высушенной амниотической жидкости
При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее
разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно
использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с
определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого
порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:
- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в
которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;
- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической
жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг.
Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и
оставляют при комнатной температуре;
- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту
нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают
оптимальное соотношение ингредиентов;
- выбранное соотношение используют для изготовления основного
объема сыворотки;
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
естественными групповыми веществами специфичности А и В
(субстанция Витебского)
Групповые специфические вещества А и В являются
высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в
производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных
желудков путем их ферментативного переваривания с последующим
осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество
группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации
антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус
добавляют групповое специфическое вещество из расчета:
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового
вещества А и 0,1 г - группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г
группового вещества В;
к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III)- 0,1 г группового
вещества А.
Для растворения группового вещества необходимое его количество
сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом
стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус,
подогретой до 37ш С, затем это групповое вещество переносят в
общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая
его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с
групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая
каждые 30 минут.
После этого сыворотку помещают в холодильник при 4ш С не
менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на
содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами
резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).
Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины
полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную
нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной
нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют
такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и
вся процедура повторяется.
При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку
исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по
изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными
эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)
Неотмытые свертки крови группы АВ(IV), оставшиеся после
отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8ш С в
течение 1-2 суток.
Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи
стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку
антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему,
занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают
50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности
групповых антител). Сыворотку, тщательно смешанную со свертком,
оставляют на 18-20 часов при 4-8ш С, после чего отделяют от
свертка путем центрифугирования.
Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус-
отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых
агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим
раствором NaCl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным разводителем.
Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна
только лишь при большом различии титра групповых и резус-антител.
Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует
развести не менее, чем в 16 раз, что возможно только в том случае,
если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже
требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.
В процессе работы в начале следует приготовить пробные
разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а
также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами
резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).
При сохранении достаточного титра резус-антител и полноте
абсорбции групповых антител разводят основной объем сыворотки
антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антител
анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D
выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус,
последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения
сыворотки.
Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми
приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если
в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции
применяются эритроциты фенотипа Ccddee, а если имеется примесь
анти-Е, то эритроциты фенотипа ccddEe. Абсорбция проводится в
течение 2-3 час. при температуре 37ш С при помешивании с
последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность.
Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.
Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих
антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже, чем
1:128 - 1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.
Сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NaCl,
сывороткой - разводителем или стандартным разводителем.
В начале следует сделать пробные порции, которые исследовать
на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность
достаточного титра резус-антител-D. При положительном результате
разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции, так и
после разведения основного объема сыворотки ее вновь обрабатывают
и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению
стандартных сывороток и реагента антирезус".
6. Получение и обработка амниотической жидкости для
использования ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой
роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть
получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию
роженицы, дату взятия, количество и по возможности группу крови
новорожденного.
Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует
группе крови новорожденного.
Оплата за сбор амниотической жидкости производится
учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную
кровь из средств на заготовку крови.
Подготовка амниотической жидкости к использованию
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают
путем определения групповой принадлежности крови новорожденного
или методом истощения агглютининов альфа и бета в
гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке
смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей
сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь
перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре.
Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на
плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III).
Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно
1:10, экспозиция 5-7 минут.
Трактовка результатов
- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и
группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости
групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе
О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации
групповых агглютининов.
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II)
и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III)
и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на
принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).
- Отсутствие агглютинации в каплях как с эритроцитами группы
А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность
амниотической жидкости к группе АВ(IV).
Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую
наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую
жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать
каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых
агглютининов.
Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы
А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой
принадлежности крови.
Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости
групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден
для работы.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на
специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный
бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера,
в которую помещают измельченную фильтровальную бумагу толщиной
5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится
прозрачной.
Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр
на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.
Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8ш С.
Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость
высушивают по 150-200 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На
флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической
жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты
высушивания.
Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной
температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую
жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до
исходного объема. После растворения используют аналогично
нативной.
Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус
антител другой специфичности", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/136, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 7
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
I. ВВЕДЕНИЕ
Определение резус-принадлежности заключается в выявлении в
эритроцитах людей антигена D системы Резус.
В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, C, c, E, e,
которые определяют с помощью соответствующих антисывороток.
Антиген d серологически не выявляется. Существуют также
разновидности антигенов резус: Du, Cw, cv, cx и другие.
Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:
D - 85%
C - 70% c - 80%
E - 30% e - 97,5%
Антигены системы Резус обладают способностью вызывать
образование изоиммунных антител.
Наиболее активным в этом отношении является антиген D, который
и подразумевается под термином резус-фактор. Именно по наличию
или отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительных
и резус-отрицательных.
Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людей
составляют 28 групп системы Резус (Табл. 1). В четырнадцати из них
содержится антиген D - они являются резус-положительными, а другие
четырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - их
относят к резус-отрицательным.
Таблица 1
СИСТЕМА РЕЗУС
+-----+------------------------------------------------------------+
| N | Резус-положительные |
| +----------------------+-------------+----------+------------+
| п/п | Фенотип | Частота в % | Генотип |Частота в % |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 1-2 | CCDEE CwCDEe | 0,00 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 3 | ССDEe | 0,07 | CDE/CDe | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 4 | CcDEE | 0,035 | CDE/cdЕ | 0,006 |
| | | | cDE/CdE | 0,029 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 5 | CcDEe | 13,69 | CDe/cDE | 12,24 |
| | | | CDE/cDe | 0,01 |
| | | | CDe/cdE | 0,97 |
| | | | cDE/Cde | 0,27 |
| | | | CDE/cde | 0,19 |
| | | | cDE/cdE | 0,006 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 6 | CwcDEe | 1,23 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 7 | ccDEe | 11,82 | cDE/cde | 10,04 |
| | | | cDE/cDe | 0,72 |
| | | | cDe/cdE | 0,06 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 8 | ccDEE | 2,49 | cDE/cDE | 2,16 |
| | | | cDE/cdE | 0,33 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 9 | CcDee | 31,93 | Cde/cde | 29,90 |
| | | | CDe/cDe | 1,98 |
| | | | cDe/Cde | 0,05 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 10 | CwcDee | 2,38 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 11 | CCDee | 16,81 | CDe/Cde | 16,01 |
| | | | CDe/Cde | 0,80 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 12 | CwCDee | 2,60 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 13 | CwCwDe | 0,00 | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 14 | ccDee | 2,21 | сDe/cde | 2,10 |
| | | | cDe/cDe | 0,11 |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| Резус-отрицательные |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 15 | ccddee | 12,71 | cde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 16 | Ccddee | 1,54 | Cde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 17 | CCddee | 0,03 | Cde/Cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 18 | Cwcddee | 0,035 | Cwde/cde | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 19 | ccddEe | 0,070 | cde/cdE | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
| 20 | CcddEe | 0,35 | Cde/cdE | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
|21-28| CwCddee CwCwddee | | | |
| | ccddEE CcddEE | 0,00 | | |
| | CCddEE CCddEe | | | |
| | CcddEe CwCddEe | | | |
+-----+----------------------+-------------+----------+------------+
II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. Определение резус-принадлежности.
Определение резус-принадлежности производится специалистом,
имеющим специальную подготовку.
Определение резус-принадлежности реципиентов производится
стандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить их
на резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (rh-).
В отличие от реципиентов определение резус-принадлежности
крови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноров
исследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров,
давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуют
дополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащими
антитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть в
сыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителами
анти-D, например: анти-D+C, анти-D+E или анти-D+C+E.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками,
т.е. не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, C, E.
Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить и
у других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и у
беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров
записывается в специальных листах или журнале и на лицевом листе
донорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц,
производивших определение.
Результат определения резус-принадлежности крови больных и
других лиц записывается в специальный журнал и на бланке с
указанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этот
бланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат,
указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правом
верхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется его
подписью с указанием даты.
2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.
Сыворотки антирезус изготавливаются обычно в виде
"универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В.
Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежности
крови людей любой группы по системе АВО.
Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групп
по системе АВО, то в этих случаях при определении
резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность
сыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяется
резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I); сывороткой
антирезус группы А(II)- только в эритроцитах групп О(I) и А(II);
сывороткой антирезус группы В(III) - только в эритроцитах групп
О(I) и В(III); сывороткой антирезус группы АВ(IV) и специально
приготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется в
эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.
3. Контрольные исследования.
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учету
крови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовления
стандартных эритроцитов".
4. Особенности стандартных сывороток антирезус.
Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности
могут содержать резус-антитела, разные по форме - полные и
неполные (см. "Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особых
условиях, поэтому методика определения резус-принадлежности
зависит от того, какие резус-антитела находятся в стандартной
сыворотке.
Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус
указывается в сопроводительной инструкции.
III. РАЗЛИЧНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
Метод определения резус-принадлежности зависит от формы
антител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.
При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая
сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого
предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.
1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации с
применением желатина в пробирке с подогревом 46-48ш С.
а) Специальное оснащение.
Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.
Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.
Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.
Водяная баня 46-48ш С. Суховоздушный термостат 46-48ш С.
10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом
- сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на
10 мл 10% раствора желатина).
Лупа с 2-4-кратным увеличением.
б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных
эритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве
5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать
фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при температуре
+4-8ш С.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты использовать для
исследования.
Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из
места укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в
пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с
желатином 1:2.
в) Техника определения. В штатив устанавливают два ряда
пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и
по две пробирки для стандартных резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные
пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл)
стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.
Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл)
10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.
Второй ряд является контролем для исключения возможного
неспецифического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая
желатиновая проба).
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48ш С на 15 минут или в
суховоздушный термостат на 25-30 минут.
При извлечении пробирок из водяной бани или термостата
доливают в них 5-8 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на свет
невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробирках
второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
(прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичности
реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой
антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях
рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим
раствором NaCl для элюирования с них аутоантител и повторить
исследование. При сомнительном результате для определения
резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в
солевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащих
полные антитела.
2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного
универсального реагента (в пробирках без подогрева).
Специальное оснащение.
стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;
33% раствор полиглюкина;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;
лупа с 2-4-кратным увеличением.
Предварительная обработка исследуемой крови не требуется.
Может быть использована кровь, взятая непосредственно перед
исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для
стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого
исследуется.
Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли
(0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33%
раствора полиглюкина.
В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно
маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки,
предназначенные для контроля, вводят стандартные
резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое
растекание крови по стенкам пробирок делает реакцию более
выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивого комплекса
антиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в виду
возможности замедленной реакции при слабо выраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
0,85% раствора NaCl и перемешивают содержимое 2-3-кратным
перевертыванием пробирок, не встряхивая.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной
(rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами,
отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра
результатов во 2-ом контрольном ряду.
Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть не
должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и,
следовательно, не позволяет учесть результат исследования как
истинный.
В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты
теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с них
аутоантител и повторить исследование.
В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности
следует применить метод агглютинации в солевой среде, используя
сыворотку с полными антителами.
3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в
сывороточной среде на плоскости с подогревом.
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пластмассовые пластины;
водяная баня 46-48ш С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычные
пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно
после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое
количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции.
Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть
сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Эритроциты используют для исследования в виде 5-10% взвеси в
собственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробирках
путем встряхивания содержимого.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника определения.
На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большой
капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали,
всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Кроме
того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной
сыворотки группы АВ (IV), не содержащей резус-антител (контроль на
неспецифическую агглютинацию).
К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю
(0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой
серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных,
одноименных с группой крови больного или группы О(I), и к третьей
капле каждой серии 1 каплю (0,05 мл) контрольных
резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой
крови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткой
группы АВ (IV), не содержащей резус-антител, добавляют 1 каплю
(0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной
палочкой и пластину опускают в водяную баню при 46-48ш С на 10
минут.
Трактовка результатов.
Результаты исследований просматривают при легком покачивании
пластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы на
почти обесцвеченном фоне жидкости.
При отрицательном результате капля остается равномерно
окрашенной в красный цвет.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+).
Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой
анти-D, являются резус-отрицательными (rh-). Однако эти
результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих
сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов
эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), а также при отрицательном
результате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), не
содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле
говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно,
положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен
как истинный. В этих случаях резус-принадлежность следует
определять, применяя другие методы исследования.
4. Определение резус-принадлежности реакцией
агглютинации в солевой среде
Специальное оснащение.
стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 см с гладким
дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций с
углублениями такой же конфигурации и объема;
лупа с 2-4-кратным увеличением;
термостат 37ш С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке
надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого
взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки
доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое их
перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего 1
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl.
2% взвесь эритроцитов употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника определения.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых
образцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей.
Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегка
накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки.
Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и
инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
Во все пробирки (лунка планшета) первого ряда вводят по 1
капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки
(лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус
другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле
изотонического раствора NaCl.
В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси испытуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
контрольных (стандартных) резус-положительных и
резус-отрицательных эритроцитов.
Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в
термостат при 37ш С на 1 час. Можно затем оставить пробирки на
столе при комнатной температуре еще на 1,5-2 часа до учета
результата.
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя
в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси
над источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше,
чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не
давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательными
(rh-).
Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в
обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных
образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки
антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными
резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии
агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I).
Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген Du.
Повторное использование сыворотки. После определения
резус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасывают
сыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку.
Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять для
определения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет,
т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартными
резус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
IV. ОБЩИЕ ПРИМЕЧАНИЯ
1. При определении резус-принадлежности независимо от метода
определения результат учитывается как истинный после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
каждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в других
контрольных пробах, применяемых для каждого метода.
2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается
слабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследовать
кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими
методами, включая метод агглютинации в солевой среде с
сыворотками, содержащими полные антитела.
Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные
антитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными
антителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты
содержат слабую разновидность антигена резус, так называемый
антиген Du, частота которого около 1%. В этих случаях
резус-принадлежность крови больного или беременной женщины
указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус-принадлежность
крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская таким
образом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.
V. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕЗУС
При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С,
анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетании
с анти-D, например D+C; D+E; D+C+E, применяются те же методы, что
и при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом
учитывается форма антител.
В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и не
содержащие соответствующий антиген.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990
года N 05-14/29, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 8
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
НА ПЛОСКОСТИ БЕЗ ПОДОГРЕВА И ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ
СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ И РЕАКТИВА АНТИРЕЗУС,
ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЭТОЙ ЦЕЛИ
Общие сведения
Методы определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения
особого лабораторного оборудования непосредственно у постели
больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при
массовых обследованиях.
Методы основаны на использовании сывороток антирезус,
изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин,
полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела
приобретают способность агглютинировать резус-положительные
эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично
реакции по определению групп крови АВО.
Наиболее удобными для практики являются методы определения на
плоскости без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива
антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с
сухим полиглюкином и альбумином.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости
без подогрева при помощи сыворотки антирезус,
приготовленной с альбумином
(прилагается при выдаче сыворотки)
Оснащение:
а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус
анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8ш С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и
справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями
наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с
сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до
получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в
течение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле
изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической
агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения
5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет - кровь
остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
При наличии агглютинации в контрольной капле, что может
произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет
аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими
методами, желательно в лабораторных условиях.
2. Определение резус-принадлежности при помощи
реактива антирезус, изготовленного с использованием
сухого полиглюкина
(прилагается при выдаче реактива)
Оснащение:
а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в
комплекте с контрольным реактивом;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно
из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со
стабилизатором не более, чем за 2 суток до исследования. Кровь
хранят при 4-8ш С.
Техника реакции.
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь
которого исследуется, и, сделав соответствующие обозначения,
наносят на нее слева 1 каплю реактива антирезус и справа - 1 каплю
контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к
контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.
Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по
пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку
периодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обе
смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капель
изотонического раствора NaCl.
Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут,
после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла
агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это
значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что
исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии
агглютинации в контроле.
При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при
некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь
необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в
лабораторных условиях.
3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности
на плоскости без подогрева
Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D.
Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей
резус-антител. Сыворотка предназначена для определения
резус-антигена D.
Материалом для изготовления сыворотки антирезус в сочетании с
альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или
специально приготовленная - универсальная с титром неполных
резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса.
Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана
годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с
"Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус".
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.
Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям,
предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам
системы АВО.
При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином
необходимы:
- альбумин 20-30% раствор, полученный из плазмы крови
человека;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови,
взятой на гепарине;
- гепарин;
- изотонический раствор NaCl.
Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора
оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор
можно вести двумя способами:
а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней
разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец
альбумина с высокой конглютинационной активностью;
б) используя один и тот же образец (серию) альбумина,
испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.
Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью.
Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128
разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцами
раствора альбумина.
Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на
пластинке с 5-6 образцами (Rh+) и с 5-6 образцами крови ccddee, а
также с кровью фенотипа Ccddee и ccddEe.
Сыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2
точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле
(0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли
перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя.
Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления и величине
агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии
агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании
этого отбирают образцы альбумина наиболее пригодные для
использования.
Для последующего использования применяют образцы альбумина,
при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов
появляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая
аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной
активностью в альбуминовой среде
Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят
отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к
ним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.
Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней
по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной
крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения
тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании
пластинки.
Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца
сыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6
образцами ccddee, а также с кровью фенотипа Сcddee и ccddEe.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию
с резус-отрицательными эритроцитами ccddee и эритроцитами генотипа
Ccddee и ccddEe.
Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус
анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация
резус-положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30
секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных
эритроцитов и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до
истечения 10 минут.
Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и
альбумина.
После выбора, альбумина с наиболее высокой конглютинирующей
способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой
агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к
подбору оптимального их соотношения, для чего:
в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;
в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии
альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую
- 8 и в пятую - 10 капель;
в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки
антирезус и содержимое тщательно перемешивают;
из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на
пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;
во все капли 1-го ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей
резус-положительной крови, во 2-ой ряд - резус-отрицательной крови
(кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови).
Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при
покачивании пластинки.
Учет и оценка результатов.
Четкая агглютинация Rh+ эритроцитов и отсутствие агглютинации
rh- эритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe
указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки
антирезус и альбумина.
Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус
анти-D в сочетании с альбумином
Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки
используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и
альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые
применялись для установления оптимального их соотношения.
К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином
добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сыворотки.
Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках
с 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцами
резус-отрицательных ccddee, а также с эритроцитами фенотипа Сcddee
и ccddEe.
При наличии четко выраженной агглютинации с
резус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, и
отрицательной реакции с резус-отрицательной кровью ccddee и кровью
фенотипа Ccddee и ccddEe, сыворотку антирезус в сочетании с
альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки
анти-D для определения резус-принадлежности на плоскости без
подогрева.
Исследование проводят с одновременным параллельным
использованием контрольной сыворотки.
Изготовление контрольной сыворотки.
Для изготовления контрольной сыворотки используют
изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней
альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в
соотношении, которые были использованы для приготовления данной
серии сыворотки антирезус.
Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано
выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна
вызывать агглютинацию эритроцитов.
Консервирование сыворотки.
Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют
борной кислотой из расчета 2 г. на 100 мл сыворотки.
Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и
контрольной сыворотки
Сыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которые
запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми
пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием
учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки,
метода, для которого она предназначена, количества, номера серии
и срока годности.
Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер
серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной
сыворотки антирезус.
Хранение, срок годности и контроль.
Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином и
контрольные сыворотки хранят при 4-8ш С.
Срок годности - 4 месяца.
По истечении срока годности, но при сохранении активности и
специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1
месяц.
Выдача сыворотки антирезус.
Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной
сывороткой.
К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.
+-------------------------+ +-------------------------+
| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|
| изготовителя | | изготовителя |
+-------------------------+ +-------------------------+
| Сыворотка антирезус-D | | Контрольная сыворотка |
| для метода на плоскости | | для метода на плоскости |
| без подогрева | | без подогрева |
| Для всех групп крови | | Для всех групп крови |
| системы АВО | | системы АВО |
| Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ |
| Годна до __________ | | Годна до __________ |
+-------------------------+ +-------------------------+
Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной
сыворотки.
4. Изготовление реактива антирезус с использованием
сухого полиглюкина для определения резус принадлежности
на плоскости без подогрева
Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D,
представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При
хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с
контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.
Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные
сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные
- универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 -
1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть
предварительно исследована и признана годной, как стандартная
сыворотка антирезус.
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит
сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как
резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная
сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к
стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении реактива антирезус необходимы:
- полиглюкин, высушенный лиофильным способом;
- альбумин-2,5% раствор;
- изотонический раствор NaCl;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.
Примечания:
1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном
аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку
ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.
2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20%
раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором
NaCl.
Изготовление реактива антирезус.
Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем
1:64 - 1:128<*> переносят во флакон с предварительно высушенным
полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина,
высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация
полиглюкина составит 6%.
---------------------------------
<*> - Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром
можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV),
стандартным разводителем или 2,5% раствором альбумина в
изотоническом растворе NaCl.
Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания
до полного растворения порошка полиглюкина.
Изготовление контрольного реактива.
Для изготовления контрольного реактива в другой такой же
флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют
стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до
исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до
полного растворения порошка полиглюкина.
Исследование качества изготовленных реактивов.
Исследование реактивов производят непосредственно после их
изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными
эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности
реакции:
на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл)
реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного
реактива;
в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл)
резус-положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной
капле резус-отрицательных эритроцитов. Содержимое капель
перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и
оставляют на три минуты периодически покачивая пластинку;
через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель
изотонического раствора NaCl, перемешивают и через две минуты
учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами
резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных
эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты
Ccddee и ссddEe.
Учет и оценка результатов.
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее
выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее
с резус-отрицательными эритроцитами (ccddee) и эритроцитами
фенотипа Ccddee и rccddEe.
Показателем пригодности реактива для последующего
использования является наличие крупнозернистой агглютинации
резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1
минуты и отсутствие ее с резус-отрицательными эритроцитами
(ccddee) и эритроцитами фенотипа CcddEe и ссddEe.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для
реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна
отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов.
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной
кислотой из расчета 2 г. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация.
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы
запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и
завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения,
изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого
он предназначен, количества,номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в таких же объемах и в том же
количестве ампул (флаконов), и также наклеивают этикетки с
соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива
повторяет номер серии основного реактива антирезус.
+-------------------------+ +-------------------------+
| Наименование учреждения-| | Наименование учреждения-|
| изготовителя | | изготовителя |
+-------------------------+ +-------------------------+
| Реактив антирезус-D | | Контрольный реактив |
| для метода на плоскости | | для метода на плоскости |
| без подогрева | | без подогрева |
| Серия ______ мл ______ | | Серия ______ мл ______ |
| Годен до __________ | | Годен до __________ |
+-------------------------+ +-------------------------+
Хранение, срок годности и контроль.
Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и
контрольный реактив хранят при 4-8ш С. Срок годности 4 месяца.
Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на
активность и специфичность через месяц.
Выдача реактива антирезус.
Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным
реактивом.
К каждому комплекту (или набору комплектов) придается
инструкция по использованию.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 06 декабря 1990 года N
05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 9
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-D
ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЖИДКОГО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
D АНТИГЕНА СИСТЕМЫ РЕЗУС
(АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИ-D)
ТУ 9398-215-27575295-95)
1. Назначение
Цоликлон анти-D предназначен для выявления D антигена системы
резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах
взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен
"Инструкцией по определению резус-принадлежности крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в
1997 году и Методическими рекомендациями по определению
резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994
года.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D
Действующим началом Цоликлон анти-D являются моноклональные
анти-D антитела, продуцируемые лимфобластоианой линией клеток
человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D
антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются
моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов,
полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D
антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена
контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.).
Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках
во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через
кровь.
Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленную или
разведенную солевым раствором культуральную жидкость,
кондиционированную клетками-продуцентами антител. Анти-D
моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G
(IgGl). Цоликлон анти-D не содержит антител иной специфичности и
поэтому может быть использован для выявления D антигена в
эритроцитах любой группы крови.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G
(неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов,
содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции
конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе
Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных
протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных
системах типа "Группоматик".
3. Техника определения D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови,
стабилизированной с помощью применяемых консервантов; в крови,
взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая
реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой
концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в
исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции
агглютинации.
3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)
Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена.
Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе трижды отмытых
исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл
взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату ((0,05
мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют в
течение 45-60 минут при 37ш С. Затем после однократного отмывания
физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1
мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно
или через 15-30 минут инкубации при комнатной температуре
центрифугируют при 200 g в течение 15-20 секунд. Осадок мягко
взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или
микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в
исследуемых эритроцитах.
3.2. Реакция конглютинации с желатином
В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл)
свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или
эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли
(0,1-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при
45-50ш С до разжижения, и одну каплю Цоликлона анти-D. Суспензию
тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или
30 минут в термостате при 48ш С, прибавляют 5-6 мл
физиологического раствора и после осторожного переворачивания
пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация
эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.
3.3. Реакция с препаратом на основе полиглюкина
Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую
агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно
объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его
слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим
использование полиглюкина для моноклональных антител не
рекомендуется.
3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными
протеолитическими ферментами
Цоликлон анти-D, содержащий моноклональные антитела класса
IgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных
эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как
бромелин, папаин и др., и поэтому может применяться в
автоматических системах типирования крови.
3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики исследования) необходимо использовать
стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
Желательно также включение образцов со слабовыраженным D
антигеном.
4. Форма выпуска
Цоликлон анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом
5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта
применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в
закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение
реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным,
протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией
направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-D диагностического
жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела
моноклональные анти-D)", утвержденную Главным техническим
Управлением Минздрава СССР 21 августа 1990 года, считать
утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 10
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ АНТИ-D IgM МОНОКЛОНАЛЬНОГО РЕАГЕНТА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-D СУПЕР)
ТУ 9398-206-27575295-94
1. Назначение
Цоликлон анти-D Cупер предназначен для выявления антигена D
системы резус в эритроцитах человека.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен
"Инструкцией по определению резус-принадлежности крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в
1997 году, и Методическими рекомендациями по определению
резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994
года.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
В связи с тем, что IgM антитела не вызывают агглютинации
некоторых образцов эритроцитов со слабовыраженным D антигеном
(Du), образцы донорской крови, которые при исследовании Цоликлоном
анти-D Супер были определены как D-отрицательные, необходимо
дополнительно тестировать с помощью анти-D реагентов, содержащих
IgG-антитела (поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D
IgG реагентом).
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона анти-D Супер
Действующим началом Цоликлон анти-D Супер являются
моноклональные анти-D антитела, которые продуцируются
гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой
лимфобластоидной линии и миеломной клеточной линией мыши.
Цоликлон анти-D Супер изготовлен на основе культуральной
жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител Анти-D.
Реагент не содержит антител иной специфичности и поэтому может
быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой
группы крови.
Моноклональные антитела, принадлежат к одному классу
иммуноглобулинов - IgM, полностью идентичны по структуре и
биологической активности. Анти-D антитела класса М являются
полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию
эритроцитов, содержащих D антиген. Цоликлон анти-D Супер может
быть использован для выявления D антигена в любых вариантах прямой
реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микроплате.
3. Определение D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови,
стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в
крови, взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
На пластину со смачиваемой поверхностью нанесите большую каплю
(около 0,1 мл) реагента. Рядом поместите маленькую каплю
(0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешайте кровь с реагентом.
Наиболее крупная агглютинация наблюдается при использовании
эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает
развиваться через 10-15 секунд, четко выраженная агглютинация
наступает через 30-60 секунд. Использование подогретой до 37-40ш С
пластинки сокращает время наступления агглютинации. Результаты
реакции учитывайте через три минуты. Пластинку после смешивания
реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30
секунд, что позволяет за это время развиться более полной
крупнолепестковой агглютинации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
В круглодонную пробирку внесите одну каплю (около 0,1 мл)
реагента и добавьте одну каплю 5% суспензии исследуемых
эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки
тщательно перемешайте встряхиванием и инкубируйте 30 минут при
комнатной температуре. После инкубации пробирку центрифугируйте
при 1500-2000 оборотах в минуту в течение одной минуты. Мягко
покачивая пробирку, отслоите осадок ото дна. При отрицательном
результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную
гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке
видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.
3.3. Реакция агглютинации в микроплате
В лунку 96-ячеечной круглодонной микроплаты внесите 0,05 мл
реагента и 0,05 мл 2% суспензии исследуемых эритроцитов в
физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды
отмойте). Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре
визуально оцените результат реакции по рисунку осадка эритроцитов
на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов
собирается в точку, при положительном - имеет больший диаметр,
располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые
края.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные
D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
5. Форма выпуска
Цоликлон анти-D Супер выпускается в жидкой форме во флаконах
объемом 2, 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве
консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - один год в холодильнике при 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в
закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение
реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным,
протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией
направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению анти-Rho (D) IgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности крови человека
(Цоликлона анти-D Супер)", утвержденную Управлением научных
исследований МЗ и МП РФ 14 июля 1994 года, считать утратившей силу
с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 11
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИССЛЕДОВАНИЮ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
I. ВВЕДЕНИЕ
Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным
антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки
человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при
особых условиях.
Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются
введение резус-отрицательному человеку резус-положительной крови
или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным
плодом.
Определение резус-антител наряду с определением
резус-принадлежности больного и донора необходимо для
предупреждения переливания резус-несовместимой крови, а также для
диагностики возможного заболевания плода или новорожденного
гемолитической болезнью.
Определение резус-антител требуется также при подготовке
материла в целях использования для приготовления сывороток
антирезус.
Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С,
анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.
Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов
они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они
реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них
резус-антигены.
Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов,
вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой
среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с
эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта
реакция ничем не проявляется.
Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между
неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные
условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин,
полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса,
реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При
всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и
эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также
проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Разные методы определения резус-антител требуют различных
оптимальных для них температурных условий.
II. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных
эритроцитов
Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей
повторными трансфузиями крови или беременностями образуются
антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и
другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке
крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными
эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, C, E, c,
e.
Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись,
то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для
того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.
В качестве контроля на специфичность реакции, а также для
выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные
резус-отрицательные - ccddee эритроциты и, если возможно,
собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.
Такое исследование является предварительным. Для уточнения
специфичности требуются дополнительные специальные исследования
(см. п. IX).
2. Учет формы антител
Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные
антитела; иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме
того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только
полные резус-антитела.
Поэтому определение резус-антител следует производить не менее
чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть
метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим -
любой метод, выявляющий неполные антитела.
III. О ВЫБОРЕ МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
Ниже в п. III, IV, V, VI описаны различные методы исследования
сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см. III), реакция с
применением желатина (см. IV) и реакция с применением полиглюкина
(см. V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может
быть использован любой из них.
Метод исследования сыворотки в солевой среде (см. VI) выявляет
полные резус-антитела и должен обязательно использоваться
одновременно с любым из упомянутых выше.
IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ НЕПОЛНЫХ РЕЗУС-АНТИТЕЛ
НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1
мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл
изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и
пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и
резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки
доливают доверху изотоническим раствором NaCl, затем содержимое
пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную
жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне
пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для
исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см
с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число
и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации
образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл ) испытуемой
сыворотки.
в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные
эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую
каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой
сывороткой согласно нумерации пробирок.
г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем
встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при
температуре +37ш С. За это время резус-антитела, если они имеются
в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический
раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют,
после чего надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание
эритроцитов повторяют 3-4 раза.
е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам
добавляют 4-7 капель изотонического раствора NaCl для получения 5%
взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются,
интенсивность взвеси контролируют глазом).
ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки
переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со
смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной
капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.
з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной
палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку
слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или
отсутствие агглютинации эритроцитов).
Агглютинация обычно начинается в течение первых 10-30 сек, но
при слабом титре резус-антител может наступить до 20 мин.
3. Трактовка результата
Наличие агглютинации в каплях с образцами резус-положительных
эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными
эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных
резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные резус-антитела - анти-D, С, Е, с и е
- не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2,
1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл)
изотонического раствора NaCl.
в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли
(0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после
перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и
т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В
результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки
от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной
маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус-положительных
эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5
резус-положительных лиц и приготовленных так же, как готовят
стандартные эритроциты.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45
мин в термостат при температуре +37ш С.
е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5%
взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл)
взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну
каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с
эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при
покачивании пластинки.
ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация
(время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных
резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех
разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше
1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и
далее продолжать исследование, как сказано выше.
V. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ
НЕПОЛНЫХ РЕЗУС-АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2-3
дня до исследования в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без
стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы,
группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для
исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской
пипеткой; если при этом захватывается небольшое количество
собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.
Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания
крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание
свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.
Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты
необходимо отмыть изотоническим раствором NaCl.
Для установления титра антител эритроциты готовят ex tempore.
В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10%
раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается
10% взвесь эритроцитов в желатине.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около
10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны
соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми
исследуется сыворотка.
б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной
капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10%
раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина
необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении
или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать
при температуре 4-8ш С желатин не пригоден).
г. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл)
испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их
содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46-48ш С на
15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.
д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5-8 мл
изотонического раствора NaCl. Содержимое пробирок перемешивают
путем одно-двукратного перевертывания их и наблюдают результат в
виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции просматривают на свет.
Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным
глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.
Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью
стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым
увеличением.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами
резус-положительных эритроцитов и отсутствие ее с
резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на
содержание в испытуемой сыворотке неполных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные резус-антитела анти-D, С, Е, а также
с и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2,
1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl.
в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1
мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания
две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей
- в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли
удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток
от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных
резус-положительных эритроцитов или смесь эритроцитов, полученных
от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже,
в виде 10% взвеси в желатине.
д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при
температуре +46-48ш С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на
30 мин.
е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по
5-8 мл изотонического раствора NaCl и наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация,
принимается за титр выявленных неполных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В
этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее
продолжать исследование, как сказано выше.
VI. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ
НЕПОЛНЫХ АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОЛИГЛЮКИНА
(В ПРОБИРКАХ БЕЗ ПОДОГРЕВА)
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-3
дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут
на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность
лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая
кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в
пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая
изотоническим раствором NaCl.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8-10 мл,
которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны
соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми
исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.
в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле
стандартных эритроцитов.
г. Во все пробирки вводят по одной капле 33% раствора
полиглюкина.
д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого,
затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно
поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое
растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой
сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.
е. Через 3-5 минут в пробирки наливают 3-4 мл изотонического
раствора NaCl, осторожно перемешивают содержимое путем 2-3 -
кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают
результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результатов
Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами
резус-положительных эритроцитов и отсутствие ее с
резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на
содержание в исследуемой сыворотке резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е
- не выявлены.
Определение специфичности антител см. п. IX.
VII. ИССЛЕДОВАНИЕ СЫВОРОТКИ НА НАЛИЧИЕ ПОЛНЫХ
АНТИТЕЛ В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в
количестве 1-2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки
вместимостью 8-10 мл, содержащие изотонический раствор
лимоннокислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки
нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята
кровь.
После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический
раствор NaCl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и
отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.
Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках,
взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же
пронумерованных.
Для приготовления 2% взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл
(49 капель) изотонического раствора NaCl и в каждую пробирку в
соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов.
Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2%
взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования
сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой
2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном
округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми
испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом
бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут
порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и
резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
Вместо пробирок можно использовать планшеты для
иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.
б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле
(0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического
раствора NaCl.
Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их
содержимого.
в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению,
вводят по одной (0,05 мл) капле 2% взвеси эритроцитов,
приготовленных в качестве стандартов.
г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают
для инкубации в термостат при +37ш С на один час и затем оставляют
на столе при комнатной температуре на 2-3 часа.
д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и
наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации
эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6-8-кратным
увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки)
(см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови методом
агглютинации в солевой среде").
Наличие агглютинации с резус-положительными образцами
эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными
эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных
резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов
указывает на то, что полные резус-антитела анти-D, С, Е, а также с
и е не выявлены.
Определение специфичности см. п. IX.
4. Титрование сыворотки, содержащей полные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения
сывороток: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать
планшет для иммунологических реакций.
б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл)
изотонического раствора NaCl.
в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две
капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из
первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй -
в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В
результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05
мл) 2% взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от
4-5 резус-положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как
сказано выше.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет)
помещают в термостат при температуре +37ш С на один час.
е. После инкубации штатив (планшет) вынимают из термостата и
наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация,
принимают за титр выявленных полных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях
сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В
таких случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее
продолжать исследование, как сказано выше.
VIII. ФЕНОМЕН ЗОНЫ
При очень высокой степени иммунизации организма образующиеся
резус-антитела иногда дают феномен зоны. Этот феномен заключается
в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной
или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую
положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными
эритроцитами. Однако, если такую сыворотку развести, то при
некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более)
резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную
положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в
методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки
непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее
чувствительности, проба Кумбса является очень ценной реакцией для
выявления неполных резус-антител.
Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в
сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого
испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус-антигену, то
для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку,
взятую в разведениях. Для этого сыворотка разводится и
испытывается, как указано для каждого метода в разделах
"Титрование сыворотки".
Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях
сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в
испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего
исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то
разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная
положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании
применяют изотонический раствор NaCl. Исследование разведенной
сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При
установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной
сыворотки, начиная с 1:2.
IX. СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНТИТЕЛ
Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые"
антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким
антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.
В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие
резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех
образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с
тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D
(наиболее часто встречающиеся), а анти-С или анти-Е.
Положительный результат может также наблюдаться и с
резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы
резус - с, е или антигенов других систем.
Для выяснения специфичности резус-антител необходимо
специальное исследование сыворотки с набором стандартных
эритроцитов, включающих редкие группы ccDee, Ccddee, ccddEe, а
также резус-отрицательные образцы (ccddee), включающие как
содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fy). С
ними же проводится и титрование сыворотки.
X. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно
сделать при положительном результате, полученном любым методом
исследования.
2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно
сделать только при отрицательном результате, полученном при
исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых
является любой метод, выявляющий неполные резус-антитела, а
другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные
резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.
"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/30, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 12
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ИЗОАНТИГЕНОВ
ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
1. Введение
Под редкими группами крови понимаются такие сочетания
групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а)
отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б)
отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе активных
и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены, г)
имеются редкие сочетания антигенов разных систем.
Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей,
чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела,
редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации
при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является
редкость или, наоборот, высокая частота антегенов, против которых
могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная
активность некоторых антигенов.
К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки,
содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С,
Е, с, е, Сw, или к одному из антигенов других систем - Келл,
Даффи, Кидд, Левис, Лютеран, MNSs и другие.
К редким сывороткам относятся также полиспецифические
сыворотки, содержащие два или более вида антител, одними из
которых чаще всего бывают антитела анти-D, а другими - антитела
редкой специфичности. К таким редким полиспецифическим сывороткам
относятся сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е,
анти-D+анти-Fyа, анти-D+Келл и другие сочетания антител анти-D с
какими-либо редкими антителами, а также все сочетания только
редких антител, например, анти-С+е, анти-С+анти-Fya и т.д.
Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к
редким группам, повышает возможность образования редких антител,
особенно, если кровь переливалась повторно, и реципиент имел в
прошлом беременности.
Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам,
иммунизированным естественным путем при беременности или
вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность
образования активных редких антител.
Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или
вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с
дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном.
Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких
сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток
антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения
сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Реиммунизация допустима для повышения активности любых
антител, так как не вносит ничего качественно нового в
иммунологический статус иммунизируемого лица и следовательно, не
создает дополнительной опасности в случае необходимости
переливания крови.
Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток
является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.
Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц
допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не
может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в
смысле возможности неблагополучных исходов последующих
беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в
редких сыворотках разной специфичности различна, для получения
таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные
способы.
2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях
Службы крови
Моноспецифические сыворотки антирезус - анти-С, анти-Е,
анти-с, анти-е, анти-Cw, а также моноспецифические сыворотки
других систем применяются наряду с сыворотками анти-D при
фенотипировании крови доноров для создания панели стандартных
эритроцитов и кадров типированных доноров, в том числе доноров
редких групп, а также для установления фенотипа крови больных и
других лиц с целью выяснения причин и предупреждения
сенсибилизации и трансфузионных осложнений.
Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е
применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на
втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом
сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы
одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е
(см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности").
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
других систем, например анти-Fya или анти-Келл, являющиеся главным
образом случайными находками, могут быть использованы при
исследовании крови резус-отрицательных лиц для определения у них
антигенов против которых направлены дополнительные антитела.
3. Источники и способы получения сыворотки
Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е
необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем,
и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.
Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров
добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не
всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток
анти-С.
Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать
только от лиц, сенсибилизированных естественным путем.
Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей
реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном
е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать
резус-положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для
которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в
большинстве случаев резус-положительная кровь.
Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд,
анти-S, анти-s, анти-Сw следует получать от лиц,
сенсибилизированных естественным путем. Поскольку такие антитела
возникают исключительно редко, чаще всего при беременности в
сочетании с многократными трансфузиями крови, то выявление таких
сенсибилизированных лиц, то есть первичный поиск редких антител
следует организовать с привлечением к этой работе отделений
переливания крови при больницах.
После выздоровления этих лиц желательно привлекать к донорству
с последующей реиммунизацией.
Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи, Кидд, S, е,
Cw разрешается только для ограниченного числа доноров в институтах
переливания крови, а также в Центре изосерологических стандартов
при Нижегородской областной станции переливания крови и Станции
переливания крови Комитета здравоохранения г. Москвы.
Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис
могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров,
поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей
врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц,
сенсибилизированных естественным путем - беременностями и
трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с
последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими
антигенами противопоказана.
Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и
анти-Левис производят путем иммунизации животных в учреждениях
судебной медицины.
Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от
лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим
привлечением их к донорству и реиммунизации.
Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и
анти-С+D+E могут быть получены почти исключительно путем
искусственной иммунизации доноров-добровольцев, так как такое
сочетание антител очень редко возникает при естественной
сенсибилизации.
Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+E и анти-C+D+E иногда
образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев
антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с
использованием тех антигенов, против которых требуется повысить
титр антител.
Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой
специфичности могут быть получены от лиц, сенсибилизированных
естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом
на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких
сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови.
Искусственная иммунизация для получения таких сывороток
противопоказана.
4. Методы иммунизации и реиммунизации
Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и
анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".
Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности
следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е
с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны
некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.
Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами
S, s, Cw следует производить аналогично иммунизации антигенами С и
Е. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения
эритроцитов. Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток
анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+E следует производить на фоне уже
имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против
которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена
аналогичны дозам при иммунизации антигенами С и Е. Длительность
курса зависит от срока появления антител.
Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка
по форме, предусмотренной действующей инструкций "По иммунизации
доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с
указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация
животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р,
анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и
лабораторным регламентам на эти сыворотки.
5. Методы и дозы взятия крови
У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для
последующего получения сыворотки или плазмы (методом
плазмафереза).
Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких
лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора
крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления
стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию
доноров крови".
6. Показатели пригодности редких сывороток для
практического использования
Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать.
Допустим, красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание
вследствие присутствия желчных пигментов.
Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для
практического использования при титре полных или неполных антител
не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких
сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с
титром 1:4.
Сыворотки анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E должны иметь титры
антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр
антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не
ниже 1:16.
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
к антигенам других систем, годны для использования в руках
специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови
при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача
комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при
титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей
редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся
другие антитела с низким титром и слабым авидитетом, то
сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в
руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови.
Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не
подлежит.
7. Организация поиска и первичное исследование сывороток
Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения
сывороток редкой специфичности следует организовать работу по
выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус-отрицательных,
так среди резус-положительных больных и доноров с привлечением к
этой работе лабораторий, в которых проводится определение
резус-принадлежности крови.
Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на
сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая
отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование
сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации,
производится на станциях переливания крови, производящих
иммунизацию.
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или
реакцией конглютинации с применением желатина для выявления
неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для
выявления полных антител.
С целью сокращения объема работы при первичном исследовании
сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно
большего числа антигенов в одном образце; удобнее всего фенотип
CcDEe, K+, Fyа+, Jk+.
В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления
антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5-6
образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов,
считая каждую смесь за один образец.
Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из
осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола
пальца.
При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител
можно производить одновременно с определением
резус-принадлежности, подвергая испытанию сыворотку каждого
исследуемого лица. При этом допустимо предварительно исследовать
сыворотку методом конглютинации с желатином с помощью одного
"стандарта" эритроцитов. В качестве такого стандарта следует
использовать смесь 2-3 образцов резус-положительных эритроцитов
группы О(I), содержащих антигены D, C, E, c, e, Cw, Келл, Fy и
другие.
Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется
далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где
устанавливается специфичность, активность и форма антител.
8. Исследование сывороток на специфичность, активность и
форму антител
Исследование сывороток начинается с проверки групповой
принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на
специфичность, активность и форму антител. Для исследования
применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с
применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде.
Следует иметь в виду, что в одной и той же сыворотке могут
содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их
специфичность может совпадать или быть различной. Так, например,
сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и
анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только
полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть
различен.
Широта исследований зависит от возможности станции переливания
крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми
указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для
дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в
республиканские станции или в институты переливания крови.
Для полного выявления антител, установления их специфичности,
формы и титра следует использовать панель типированных стандартных
эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать
эритроциты группы О(I).
В качестве образцов в панель можно включать эритроциты
типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в
изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты
перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором
хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3
дня, после отмывания - 1 день.
Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с
консервантом, применяемым для консервирования крови, она может
храниться 1 месяц при +4-8ш С. Перед использованием эритроциты
двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок
годности отмытых эритроцитов 1 день.
Более эффективно использование эритроцитов доноров редких
групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах
- 2-5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными
растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы
долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов,
предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты
используются в тот же день.
В панели должны быть представлены стандартные эритроциты,
позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах
следующих систем: Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, MNSs, Лютеран,
Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть
расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так,
чтобы по возможности были включены как положительные, так и
отрицательные образцы для каждого антигена.
Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные
образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных
содержащие пять антигенов системы резус-CcDEe. В этих же образцах
имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем.
Таким образом, положительная реакция с этими образцами укажет на
наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их
специфичности.
Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам
CCDEe, CcDEE, CcDee, CCDee, ссDEe и ccDEE. Часть их гомозиготна, а
часть гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для
идентификации антител анти-с и анти-е.
Затем следуют образцы фенотипов ccDee, Ccddde и cccdEe. Эти
образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе
резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием
антигена С (фенотип ССdee). Этот образец дает возможность
идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например,
анти-D+анти-с.
Среди резус-положительных образцов в панели должны быть
разновидности с содержанием антигена Du и антигена Cw. Образец Du
служит для того, чтобы установить достаточно ли активны антитела
анти-D. Образец с содержанием антигена Cw служит для выявления
антител анти-Cw.
Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная
реакция с которыми указывает на наличие антител по другим
системам. Эти образцы содержат разнообразные сочетания антигенов
других систем: положительные и отрицательные по антигенам Fya, Fyb
и Кидд.
Необходимы Келл-положительные образцы. Некоторые из них
чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащие второго аллеля этой
системы, т.е. Челлано-отрицательные. Келл-положительные образцы
подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них
антигенов Даффи.
Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить
специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как
антитела анти-Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте
после антител антирезус.
Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает
различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами
этой системы - Jka-; Jkb-; Lea+; Leb-.
И, наконец, в панели представлены фенотипы по другим системам
MNSs, P, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия
по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.
Использование представленной панели стандартных эритроцитов
дает возможность выявлять и определять специфичность полных и
неполных антител всех серологических систем как в том случае,
когда эти антитела одной специфичности, так и в том, когда
антитела различаются и по специфичности, и по форме.
В практической работе исследование следует начинать следующим
порядком: сначала используются выборочно 10-12 образцов
эритроцитов, подобранных с таким расчетом, чтобы выявить
сенсибилизацию к любому из основных антигенов резус - D, C, E, c,
e, Cw. Среди резус-отрицательных включаются образцы также с
максимальным набором различных других антигенов.
Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной
специфичности или их сочетание, то агглютинация наступает также с
соответствующими образцами эритроцитов.
Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы,
имеющие антигены Fy или Келл, то следует произвести дополнительные
исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа
по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует
резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fy и Келл,
то панель для исследования следует еще более расширить с
включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд,
Левис, MNSs и т.д.
Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для
первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то
проводятся дополнительные исследования с использованием
стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих
антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами
свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и
анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует
иметь в виду другие, широко распространенные антигены, например,
Челлано и поэтому использовать Челлано-отрицательные стандарты. В
случае положительного результата и с этим стандартом следует
расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных
по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить
наличие в сыворотке нескольких антител.
Титрование сыворотки. После выявления антител и установления
их специфичности и формы следует определить титр антител.
Титрование проводится отдельно для неполных и полных антител
непрямой пробой Кумбса, в методе конглютинации с желатином и
реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию
сывороток антирезус (см. инструкцию "По исследованию сывороток на
наличие резус-антител"). Для титрования используются образцы
эритроцитов, содержащие антиген, против которого направлены
антитела. По возможности титрование проводится с гомозиготными и
гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является
обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом
дозы и будучи активными с гомозиготными образцами (сс) могут
оказаться неактивными и дать ложноотрицательный результат при
исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о
возможности практического использования таких сывороток
учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается
на этикетке.
Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки дает
возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в
сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая
сыворотка, имеющаяся в достаточном количестве, для дальнейшего ее
использования должна быть обработана и расфасована, как указано в
пункте 10. Расфасованные сыворотки хранятся в течение 3 недель,
после чего проводится их стандартизация.
9. Стандартизация сыворотки
Стандартизация редких сывороток производится на областных
станциях переливания крови, располагающих необходимыми
стандартами, или на станциях и в институтах переливания крови. При
стандартизации производятся исследования, предусмотренные в
параграфе 8. Результаты сопоставляются с данными, указанными на
этикетке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки
флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.
При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой
специфичности, формы и титра антитела содержатся в данной
сыворотке и для определения какого (каких) антигенов и в какой
именно реакции пригодна данная сыворотка.
Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в
пункте 6, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже
требуемого и при этом правильно оформлены этикетки и наставление
по использованию, то учреждение, проводившее стандартизацию, дает
заключение о возможности использования данной сыворотки как
стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение,
представившее сыворотку для стандартизации.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в
учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с
указанием причин непригодности сыворотки или неправильности,
имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по
возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае затруднений проведения стандартизации (наличие
каких-либо неизвестных антител и т.п.) редкие сыворотки
могут направляться в Центр по изучению и стандартизации групп
крови в ГНЦ РАМН.
Центр по изучению и стандартизации групп крови производит
также выборочный контроль редких сывороток, изготавливаемых в
учреждениях Службы крови страны.
10. Обработка и расфасовка сыворотки
После того, как у сенсибилизированного лица при первичном
исследовании его сыворотки выявлены редкие антитела, от него
получают сыворотку или плазму (методом плазмафереза). Сыворотку
консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл
сыворотки или азида натрия 1 г на 1000 мл. К плазме для удаления
фибрина добавляют 10% раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на
100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в
другой флакон и так же консервируют.
На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием
фамилии, и.о. донора, групповой принадлежности по системе АВО и
характеристики изоиммунных антител с теми подробностями, которые
удалось выявить при первичном исследовании. Через два-три дня
(можно несколько позже) сыворотку вновь исследуют на наличие,
специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 8.
Результат исследования записывают на этикетке сосуда с сывороткой
и регистрируют в журнале.
Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется
возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое
количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как
сказано выше. Флаконы с сывороткой хранят при +4-8ш С.
Если показатели специфичности и активности (титра) антител и
внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 6,
сыворотку можно считать пригодной для практического использования
и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в
зависимости от предполагаемых объемов использования. Чем большая
редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки
сыворотки.
Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.
Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется
специфичность, форма и активность антител, проверяется
правильность паспортизации и решается вопрос о возможности
использования этой сыворотки и методе, рекомендуемом для
практической работы.
Для удаления антител системы АВО сыворотки рекомендуется
абсорбировать. Абсорбция проводится эритроцитами соответствующей
групповой принадлежности с отсутствием в них антигена, против
которого в сыворотке имеются изоиммунные антитела. Абсорбция или
нейтрализация антител альфа и бета проводится после исследования
сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до
ее расфасовки.
После абсорбции и еще через три недели сыворотку исследуют на
наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и
титр изоиммунных антител. Если групповые антитела альфа и бета
исчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям,
указанным в пункте 6, сыворотку можно расфасовать.
11. Паспортизация сыворотки
На ампулы (флаконы) с расфасованной сывороткой наклеивают
этикетки, на которых указывают: название учреждения и город, где
изготовлена сыворотка, номер серии (или символ, избранный для ее
обозначения), например, сокращенная фамилия донора,
специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Указывается
также групповая принадлежность по системе АВО. Для сыворотки
группы АВ(IV) или, специально абсорбированной, вместо символа,
обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова "для всех
групп крови". На этикетках наносятся по диагонали цветные полосы:
для группы А(II) - две синие, для группы B(III) - три красные, для
сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые.
На этикетках указывается количество, срок годности и условия
хранения.
ПРИМЕРЫ НАСТАВЛЕНИЙ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕДКИХ СЫВОРОТОК
+-----------------------------------------------------------------+
| СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ |
+-----------------------------------------------------------------+
| Стандартная сыворотка для определения |
| антигенов эритроцитов |
| методом конглютинации с желатином в пробирках |
| |
| Метод использования: |
| |
|1. В пробирку к одной капле сыворотки (0,05 мл) добавить одну|
| каплю испытуемых эритроцитов (0,05 мл) и 2 капли желатина (0,1|
| мл). Содержимое перемешать путем встряхивания. |
| |
|2. Инкубировать в термостате при +48 - +50ш С в течение 30 минут|
| или в водяной бане при +48 - +50ш С в течение 15 минут. |
| |
|3. После прогревания в пробирку долить 8-10 мл физиологического|
| раствора, содержимое перемешать путем перевертывания пробирки.|
| |
|4. Учесть результат реакции. |
| |
| Во всех сомнительных случаях результат оценить путем микроско-|
| пирования. |
| |
| Серия 85 анти- Е для всех групп крови |
| ------- ---- ----- |
+-----------------------------------------------------------------+
+-----------------------------------------------------------------+
| СТАНЦИЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ КЗ г. МОСКВЫ |
+-----------------------------------------------------------------+
| Стандартная сыворотка для определения |
| антигенов эритроцитов |
| в методе солевой агглютинации |
| (в маленьких пробирках или на планшетах) |
| |
| Метод использования: |
| |
|1. Приготовить 2% взвесь эритроцитов дважды отмытых изотоническим|
| раствором хлорида натрия. |
| |
|2. К одной капле тест-сыворотки добавить одну каплю исследуемой|
| взвеси эритроцитов. |
| |
|3. Инкубировать пробирки (планшеты) 1 час при температуре 37ш С. |
| |
|4. Учесть результаты реакции с помощью лупы. |
| |
| Серия 52 анти- С для всех групп крови |
| ------ ---- ----- |
+-----------------------------------------------------------------+
12. Хранение и выдача сыворотки
Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном
состоянии при температуре не выше -15ш С или при +4- 8шС.
Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд
учреждений, в которых они изготовлены и могут выдаваться в другие
учреждения Службы крови.
При выдаче сыворотки к ней прилагают наставление по
использованию, в котором указывают, в каком методе для каждого из
антител следует использовать данную сыворотку.
При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в
целях экономии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок
годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии -
один год, при хранении в условиях +4-8ш С - четыре месяца. По
истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не
снизился или снизился не более чем на два разведения и при этом
сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок
продляют еще на два месяца. Если через два месяца титр также
сохранился - срок снова продляется.
"Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп,
предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов
человека", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 26
марта 1979 года N 06-14/3, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 13
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-С МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА С СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-С СУПЕР)
ТУ 9398-207-27575295-94
1. Назначение
Цоликлон анти-С Супер предназначен для выявления антигена С
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-С сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-С антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-С
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-С Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию С+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена С
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена С
Цоликлон анти-С Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена С производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На предварительно подогретую (35-40ш С) пластинку
нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну
маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02-0,05 мл) и
смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-С и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37ш
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные С+ и
С- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-С Супер - один год при
температуре 2-8ш С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8ш С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-rh' (С)
моноклонального для определения антигена С системы резус на
эритроцитах человека (Цоликлон анти-С Супер)", утвержденную
Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта
1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 14
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНА АНТИ-Е МОНОКЛОНАЛЬНОГО
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА E СИСТЕМЫ РЕЗУС
НА ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА
(ЦОЛИКЛОН АНТИ-E СУПЕР)
1. Назначение
Цоликлон анти-E Супер предназначен для выявления антигена E
системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой
гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с
аллоиммунной анти-E сывороткой.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева,
Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-Е антитела продуцируются
бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-Е
Супер изготавливается на основе культуральной жидкости,
кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология
производства реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-Е Супер содержит IgM антитела, которые
вызывают прямую агглютинацию Е+ эритроцитов. Реагент не содержит
антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена Е
в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена Е
Цоликлон анти-Е Супер может быть использован в реакции
агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение
антигена Е производится в нативной крови с консервантом, в крови
без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На пластинку нанести одну большую каплю реагента
(примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или
эритроцитов (0,02-0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20-30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию
агглютинации. Четкая реакция наступает через 30-60 секунд после
смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат
реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и
четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в
высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5%
суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона
анти-Е и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37ш
С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500-3000 оборотах в
минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном
результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует
гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате
осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов
на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо
от применяемой методики) необходимо использовать стандартные Е+ и
Е- эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-Е Супер - один год при
температуре 2-8ш С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре
- 2-8ш С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с
результатами тестирования и 2-3 невскрытых флакона с Цоликлоном
данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 15
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ ПОСТРАНСФУЗИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ,
ОБУСЛОВЛЕННЫХ ФАКТОРАМИ КЕLL И C(HR')
Наиболее выраженными антигенными свойствами среди минорных
антигенов эритроцитов обладают факторы Kell (K) и с. Фактор К
стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно
опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.
--------------------------------
<*> - Составители: С.И.Донсков, А.Г.Башлай, Т.М.Пискунова,
В.И.Червяков, И.С.Липатова.
Индекс сенсибилизации (процент лиц с повышенным риском
посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам
высокий.
Фактор К встречается примерно у 10% людей, поэтому почти
каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной
крови К-отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность -
это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом.
С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору
К, необходимо выдавать в лечебные учреждения К-отрицательные
эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях переливания крови
следует производить определение К фактора у всех доноров в
обязательном порядке наряду с определением групповой- и
резус-принадлежности крови, после чего отбирать К-положительные
образцы, не допуская их выдачи для переливания К-отрицательным
больным.
К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид
донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не
эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить
индекс сенсибилизации населения к фактору К, что в свою очередь
будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений,
обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической
болезни новорожденных.
Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью
следующих методов:
1. Непрямая проба Кумбса.
2. Желатиновый метод в пробирках.
3. Экспресс-метод на плоскости.
Индекс сенсибилизации населения к фактору с так же достаточно
высок. Около 20% людей не содержат антигена С в эритроцитах.
Именно эти люди представляют группу повышенного риска развития
посттрансфузионного осложнения, поскольку им в 80% случаев
переливают эритроциты, содержащие фактор с. Число переливаний
с-положительных эритроцитов с-отрицательным реципиентам составляет
16 на 100 гемотрансфузий. Число беременностей с-положительным
плодом с-отрицательных женщин составляют также 16 на 100.
С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и
избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных
несовместимостью по этому фактору, целесообразно у каждого
резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его
отсутствии переливать реципиенту кровь доноров с-отрицательных
(гомозиготных по антигену С). На станциях и в отделениях
переливания крови необходимо иметь резервную группу таких доноров
или запас с-отрицательной эритроцитной массы.
Антиген с определяют теми же методами, что и антиген D.
Инструкция
по определению Келл-фактора экспресс-методом
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К
универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с
гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы.
Для исследования используют свежие - не более 2-х дневного
хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки
после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов),
плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют
также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно
перед исследованием.
Техника определения: на плоскость помещают одну каплю (0,05
-0,06 мл)<*> сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3
от объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой
и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за
ходом реакции в течение 5 минут.
--------------------------------
<*> - 1 мл сыворотки анти-К расходуется на 15-20 исследований.
Оценка результатов: при положительном результате агглютинация
эритроцитов появляется к 30 сек - 1 мин и в дальнейшем
усиливается, при отрицательном результате агглютинация
отсутствует. По истечении 3-4 минут в реагирующую смесь добавляют
1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной
неспецифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до
истечения 5 минут, после чего регистрируют результат (см. рис.)<*>
--------------------------------
<*> - рисунок не приводится.
ВНИМАНИЕ! Во избежание ошибок рекомендуется использовать
осадок эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей
среды.
Срок годности сывороток - четыре месяца.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 16
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИММУНИЗАЦИИ ДОНОРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ
И ИММУНОГЛОБУЛИНА АНТИРЕЗУС
1. Выбор доноров для иммунизации
К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться
доноры-мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или
моложе, если у них уже наступила менопауза.
Реиммунизация может производиться лицам, ранее
сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных
беременностей или введения им крови.
Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления
с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц и с их
согласия, данного в письменной форме.
Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и
сенсибилизированные лица, привлеченные к донорству, проходят
врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому
освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови",
утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29
мая 1995 года.
Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщины
выкидышей, мертворождений, гемолитической болезни у их
новорожденных и другой патологии, связанной с резус-конфликтом, не
является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и
последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого
контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее
120 г/л, количества эритроцитов - не менее 3,7 х 10 12/л,
лейкоцитов до 10х10 9/л, палочкоядерных нейтрофилов до 10%,
лимфоцитов до 45%.
У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию,
проводят исследования на антиген гепатита В, антитела к вирусу
иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание
аланинаминотрасферазы. Эти исследования повторяют перед каждым
курсом иммунизации и реиммунизации.
К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови антигена
гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека
(ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы.
Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь
которых будет использована в качестве антигена, титруют по
антигенам системы резус: D, C, E, c, e и по возможности других
систем (Келл, Даффи и т.д.).
До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие
различных резус-антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса.
Положительный результат прямой пробы Кумбса является
противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и
вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител
устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают
возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или
иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител
такому лицу можно проводить реиммунизацию.
После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана
справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае
необходимости гемотрансфузии.
Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге,
отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный
влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие
сведения:
- город и название учреждения, производившего иммунизацию и
выдавшего справку,
- фамилия, имя, отчество донора,
- группа крови по системе АВО;
- резус-принадлежность (фенотип);
- чем иммунизировали (резус-антиген);
- при необходимости гемотрансфузий обязателен индивидуальный
подбор совместимой крови только от резус ........ лиц.
Справка должна быть подписана руководителем учреждения с
указанием даты и скреплена печатью.
2. Подготовка донора, кровь которого
используется в качестве антигена
Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты
консервированной крови активных доноров группы О(I) или
одноименной с кровью иммунизируемого лица.
Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров,
дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть
обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения
латентно протекающего заболевания печени.
Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против
которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен
отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью.
Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти
человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же
донора.
Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается
стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и
годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем
прокола пробки кровь должна быть использована сразу для
иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после
вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается.
Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные
размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для
этой среды.
Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой
активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по
быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с
антисывороткой соответствующей специфичности.
При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется
для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и
того же донора, преимущественно свежеконсервированные.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в
специально отведенном помещении, в котором не производится работа
с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными
лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией
проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков.
Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при
отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.
Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса
иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на
наличие, специфичность и активность антител.
Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров
антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах
могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения
антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев
между курсами, и в дозах - в пределах+-5 мл.
При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь,
используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна
быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц
фенотипа ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа
ccDee. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой
иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела
анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц
фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа
ccDee, а также фенотипа CcDee.
Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа
CCddee кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду
возможности образования у них антител анти-с.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови,
последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними
три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс
иммунизации.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по
три-четыре дня.
Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не
выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса
следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные
второму курсу.
Если после четвертого курса у донора не выработается антител,
через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами, следует
провести сокращенные курсы по типу реиммунизации.
Если и после такой длительной иммунизации антитела не
образуются, донора от иммунизации отстраняют.
После выработки у донора активных антител для сохранения и
дальнейшего повышения их титра им необходимо периодически
проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизация доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались
антитела-D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее
беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает
возможность сохранить титр антитела в крови иммунизируемых лиц или
добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации
проводится так же, как и для иммунизации.
Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания
иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре
месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями
крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре
месяца, но только вне периода беременности и лактации.
Курс реиммунизации состоит из
двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови
донора по 2-3 мл с интервалом два-три дня. Такие курсы повторяются
каждые четыре месяца.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от
четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр
антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры
анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются
не ранее, чем через полтора года.
Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают
выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее,
чем у 70% иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие
сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов,
применяемых для иммунизации:
+------------+----------------------+----------------------------+
|Планируемые | Фенотип крови | Фенотип эритроцитов, |
| антитела | иммунизируемого лица | применяемых для иммунизации|
+------------+----------------------+-----------------+----------+
| | ccddee | Ccddee | CCddee |
| +----------------------+-----------------+----------+
| анти-С | ccDee | Ccddee | CCddee |
| | ccDEe | CcDee | CCDee |
| | | CcDEe | CCDEe |
+------------+----------------------+-----------------+----------+
| | ccddee | ccddEe | |
| анти-Е | Ccddee | | |
| +----------------------+-----------------+----------+
| | CcDee | ccddEe | ccDEE |
| | | ccDEe | CcDEE |
| | | CcDEe | |
+------------+----------------------+-----------------+----------+
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы
иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови
донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по
2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре
месяца.
Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных
введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по
1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный
второму, и так повторяют каждые четыре месяца.
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных
инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция -
10 мл и последующие пять - 5 мл. Через восемь - десять месяцев
проводится второй курс.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных
инъекций крови по 5 мл с интервалами по три-четыре дня.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у
донора не выработались антитела, выработались антитела с низким
титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца
проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный
второму, и так повторяется каждые четыре месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев
(полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации.
Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8
для неполных антител и 1:2 - 1:32 для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного
влияния на состояние здоровья доноров.
В процессе иммунизации, а также после выработки антител при
взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться
преходящие изменения периферической крови, например, увеличение
количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов до 12%,
лимфоцитов до 45%, повышение содержания общего количества
лейкоцитов до 10х10 в степ. 9 /л, общего билирубина до 20,5
мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей,
пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при
37ш С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения
иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы
(плазмаферез).
Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц,
обработка сывороток и их испытание производятся согласно
действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".
Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится
по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства
здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов
Российской Федерации.
Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы
(плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к
неиммунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам
Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения
субъектов Российской Федерации.
С целью увеличения количества изоиммунных доноров крови,
плазмы разрешается дополнительная оплата изоиммунным донорам за
дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления
здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Изоиммунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в
лечебных учреждениях.
Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения
сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством
здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/138, считать
утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 17
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ВЗЯТИЮ И УЧЕТУ КРОВИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ОТ
ДОНОРОВ МАЛЫМИ ДОЗАМИ, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в
других лечебно-профилактических учреждениях, где производится
определение резус-принадлежности и изготовление сывороток
антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров,
у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.
Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при
определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении
антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении
стандартных сывороток, предназначенных для определения группы
крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для
выявления антигенов эритроцитов.
1.1. При определении группы крови необходимо иметь контрольные
эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В;
1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих
сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте
1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2;
1.3. при определении резус-принадлежности необходимы
контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты;
1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при
выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты
доноров, указанных в пункте "в", и дополнительно подобрать доноров
групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному
резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти
доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от
наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть
пополнено за счет доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах
доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, C, E, c,
e, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем
К - k, Fya - Fyb и других систем эритроцитов;
1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности
необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в
пунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных
эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и
отрицательные по различным антигенам.
2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у
доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в
зависимости от потребности.
3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете
отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен
донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь
малыми дозами, не входит в состав учреждения Службы крови, донор
находится на учете непосредственно в этой лаборатории.
При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца)
донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется
содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови
допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г% (120
г/л) для женщин и 13 г% (130 г/л) - для мужчин.
4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления
стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия
крови по следующей форме:
Фамилия ______________ имя _____________отчество _____________
Группа крови _________________________,
фенотип по различным системам эритроцитов ____________________
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
| 1. Дата |1. Количество|1. Расписка |1. Расписка лица,| 1. Расписка лица,|
|взятия крови| взятой крови|донора, давшего| взявшего кровь | использовавшего |
| | | кровь | | кровь для работы |
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
| 2. |2. |2. |2. | 2. |
| | | | | |
+------------+-------------+---------------+-----------------+------------------+
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 месяца.
Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд
которого бралась кровь.
6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в
книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен
указать количество взятой крови и за какой период времени взята
кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.
7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры
взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь
устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации,
установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.
8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для
приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все
льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным,
согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и
органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной
день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве
не менее 100 мл.
"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов",
утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976
года N 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения
данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 18
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ
ГРУППОВОЙ СИСТЕМЫ АВО
I. ВВЕДЕНИЕ
Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными
(естественными) у человека. Они относятся к полным антителам -
агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются
при комнатной температуре и хуже при температуре 37ш С. Добавление
в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител,
непрямой пробой Кумбса их не выявляют.
Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из
сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они
чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при
70ш С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела
полностью потеряли активность.
Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у
человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы,
которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и
анти-В.
Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но
могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном
поступлении в организм несовместимого в групповом отношении
антигена, при иногруппной беременности, при ошибочном переливании
крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении
некоторых прививок и иммунизации.
При иногруппной беременности, послужившей причиной
гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В
почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения
больного ребенка. При этом им обычно сопутствует высокий титр
нормальных антител альфа и бета.
При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные
антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый-седьмой
день, достигая максимума к пятнадцатому-двадцать пятому дню с
последующим падением их титра.
В крови у таких больных одновременно повышается титр
нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с
последующим снижением после 25-30 дня.
Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной, так
и неполной форме. Они активны при 37ш С, могут иметь несколько
более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по
сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные
антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической
субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и
сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут
при температуре 70ш С, т.е. при условиях, при которых нормальные
антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление
изоиммунных антител может служить ценным диагностическим
признаком, в частности, при решении вопроса о причинах
гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни
новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в
практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител
альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти-В является их
поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и
основано применение разных методов для выявления нормальных
антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см.
разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде
способности вызывать агглютинацию эритроцитов при проведении
реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой
пробе Кумбса.
Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же
причинами, могут одновременно образовываться гемолизины, которым
свойственна также групповая специфичность (Методы определения
групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).
II. ОСНАЩЕНИЕ
При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А,
анти-В необходимо следующее оснащение:
- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь
эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;
- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки центрифужные;
- пробирки маленькие высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром
5-6 мм и с гладким дном округлой формы;
- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;
- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
- штативы;
- термостат 37ш С;
- центрифуга;
- водяная баня 70ш С.
III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНЫХ ИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
РЕАКЦИЕЙ СОЛЕВОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl путем
центрифугирования, после чего на дне пробирки остается
эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и
отдельно каждой группы.
Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре
раза изотоническим раствором NaCl во избежание коагуляции при
нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из
которых прогревают в течение 10 минут при 70ш С, точно соблюдая
температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки
- нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.
Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой
среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных
антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой
пробой Кумбса.
2. Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив
устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании
сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив
предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают
отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и
группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови
стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения
помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).
Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по
две капли изотонического раствора NaCl. Затем в первую и во вторую
пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной
непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.
Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с
изотоническим раствором NaCl и две капли этой смеси переносят в
третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в
четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В
результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до
1:8000.
В другом штативе также приготавливают разведения
предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно
достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от
1:4 до 1:128).
После приготовления разведений сыворотки во все пробирки
добавляют по одной капле 2-3% взвеси стандартных эритроцитов
противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) -
эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) -
эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы О(I)
в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой
ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы
оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной
температуре, с прогретой - при 37ш С.
3. Трактовка результатов.
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне
пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением
над источником света.
При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков
неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь
краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов
располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде
правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у
каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных
антител, а последнее разведение, в котором она наблюдается - об их
титре.
Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к
агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке
- к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если
агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить
исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках с прогретой
сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕПОЛНЫХ ИЗОИММУННЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО
НЕПРЯМОЙ ПРОБОЙ КУМБСА
1. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и
В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl, после чего на
дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для
исследования.
2.Техника реакции.
При исследовании сыворотки группы А(II) или В (III) в штатив
устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) -
два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно
накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для
установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой
пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для
реакции солевой агглютинации.
Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли
изотонического раствора NaCl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по
три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее
приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода
солевой агглютинации, но в объеме трех капель.
Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной
маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы,
смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помещают для инкубации
в термостат на 45 минут при 37ш С. За это время иммунные антитела,
если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки
доливают изотонический раствор NaCl, перемешивают их содержимое и
центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание
повторяют три раза.
После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель
изотонического раствора NaCl для получения приблизительно 5%
взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой
взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью,
пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно
номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле
сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой.
Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом
покачивании пластинки.
Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации,
видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление
агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс
(+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах.
Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных
антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение,
в котором оно наблюдается - об их титре<*>.
--------------------------------
<*> - Контроль в отношении возможного ложно-положительного
результата за счет активных полных антител не требуется, т.к. в
данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только
при отрицательном результате в солевой среде.
В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках,
следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об
отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции
исследуемой сыворотки.
3. Трактовка результатов.
В ходе вышеописанного исследования определяются три вида
антител:
- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета
(термолабильные);
- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные);
- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В
(термостабильные).
Общее заключение делается на основании сопоставления
результатов всех исследований:
а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или
неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в
организм человека антигена, несовместимых полных (термолабильных)
антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 -
для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных
антител;
б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа
и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном
методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных
антител в момент исследования, отражает состояние повышенной
сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о
бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого
по системе АВО;
в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В
при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не
выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об
отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы
АВО к моменту данного исследования.
V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИЗИНОВ СИСТЕМЫ АВО
1. Оснащение,
- стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III);
- изотонический раствор NaCl;
- пробирки вместимостью 8-10 мл;
- маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см;
- штативы;
- термостат 37ш С;
- центрифуга.
2. Подготовительная работа.
Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также
эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоническим
раствором NaCl путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь
в изотоническом растворе NaCl.
Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не
более 48 часов при температуре 4-8ш С.
В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью
8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом
растворе NaCl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.
3. Техника реакции.
В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда
при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда
- при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют
одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с
исходными разведениями сыворотки.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором
накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают
фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу
крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в
пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят
соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так,
чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4
и т.д. до 1:32.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5% взвеси
эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты
лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также
контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят
эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если
исследуется сыворотка группы А(II), или группы А(II), если
исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки
группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в
четвертый ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания
и штатив помещают на 45 минут при температуре 37 шС, затем
пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат
невооруженным глазом в проходящем свете.
4. Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие
групповых гемолизинов анти-А и анти-В.
Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся
эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности
окрашивания надосадочной жидкости:
- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а
надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые
гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),
- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочная
жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности
(иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это
значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые
гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от
одного плюса (+) до трех плюсов (+++)),
- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена
в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой
сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на
четыре плюса (++++).
Результаты учитываются как истинные, т.е. относящиеся к
гемолизинам анти-А и анти-В, только при отсутствии гемолиза в двух
контрольных рядах.
При наличии гемолиза не только с эритроцитами противоположной
группы, но и в контрольных рядах - исследование повторяют. При
подтверждении результатов реакции следует решать вопрос о природе
обнаруженных гемолизинов, с учетом характера заболевания и других
показателей.
Методические рекомендации "Определение иммунных антител
групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения
СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/135, считать утратившими силу с
момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 19
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ
ЭРИТРОЦИТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЮ В
ИЗОСЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания
аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных
антител в сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови
АВО перекрестным способом, при определении резус-принадлежности
крови, а также для проведения контроля специфичности и активности
стандартных изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток
антирезус; тест-сывороток и реактивов, предназначенных для
определения антигенов различных систем эритроцитов крови человека.
Стандартные эритроциты группы О(I) должны содержать в эритроцитах
клинически значимые антигены: D, C, Cw, c, E, e, K, k, Fy, Jk, M,
N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов
можно производить их консервирование специально изготовленными
консервирующими растворами.
I. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К СТАНДАРТНЫМ ЭРИТРОЦИТАМ
Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны
давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со
стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать
агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного
антигена эритроцитов.
Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для
выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64,
эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления
агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.
Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных
изогемагглютинирующих сывороток группы Абета(II) (анти-В) и
Вальфа(III) (анти-А) или соответствующих моноклональных антител,
удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.
Время наступления агглютинации эритроцитов А1 и В со
стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять
не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А3, В2 - не более
двух минут.
Стандартные эритроциты группы крови О(I) не должны давать
агглютинации со стандартными сыворотками групп крови Оальфа
бета(I), Абета(II), Вальфа(III) в течение двадцати минут.
Стандартные резус-положительные эритроциты группы крови О(I),
содержащие антиген D, а также антигены С, Cw, c и E, e в различных
сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы резус,
должны давать соответственно со стандартными сыворотками анти-D,
анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е и анти-е четкую агглютинацию при
определении методом конглютинации с желатином, экспресс-методом
в пробирках или на плоскости без подогрева или непрямой пробе
Кумбса в зависимости от того, для какого метода исследования
предназначена данная стандартная сыворотка антирезус.
Стандартные резус-отрицательные эритроциты О(I) фенотипа
ccddee не должны давать агглютинации с реактивами антирезус,
содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах
исследования, для использования в которых предназначены указанные
реактивы антирезус.
Время наблюдения за отрицательной реакцией должно
соответствовать времени, установленному для каждой из этих
реакций.
II. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Приготовление стандартных эритроцитов производится в условиях
строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления
консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в
консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции
и контрольных исследований.
1. Изготовление консервирующего раствора для стандартных
эритроцитов.
Консервирующей средой для приготовления стандартных
эритроцитов могут служить растворы следующего состава:
Консервант N 1:
сорбит 40,0 г
глюкоза 6,0 г
Na2HPO4х12H20 2,0 г
KH2PO4 0,9 г
левомицетин 0,06 г
этиловый спирт 96ш 100 мл
вода бидистиллированная до 1000 мл
рН раствора 6,8-6,9
В случае необходимости доведения рН до требуемой величины
добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или
Na2HPO4х12H20.
Консервант N 2:
аденин 0,03 г
инозин 0,06 г
лимонная кислота 1,5 г
глюкоза 3,0 г
Na3PO4 0,4 г
NaOH 1н 20 мл
вода дистиллированная до 100 мл
рН раствора 6,3-6,4
Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой
прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизация
консервантов производится путем фильтрования их через
соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в
стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно
закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими
колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае
помутнения консервирующего раствора или появления желтого
окрашивания применение его для работы недопустимо.
2. Получение взвеси эритроцитов в консерванте
Источником получения стандартных эритроцитов является
эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из
консервированной крови доноров. Кровь берут от доноров, фенотип
эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных
эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного
материала должна быть использована эритроцитная масса от одного
специально отобранного донора.
А для получения стандартных эритроцитов других систем можно
использовать смесь эритроцитов группы О(I) от нескольких (2-4)
доноров различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких
антигенов: К, Сw, Е присутствовали в эритроцитах не менее чем у
двух доноров. Используется эритроцитная масса, полученная не
позднее 2-3 суток от момента заготовки крови.
В боксе через стерильную систему путем прокола переливают
эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так,
чтобы соотношение эритромассы и консервантов было 1:4. Содержимое
флакона острожно перемешивают и разливают той же системой в
стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему
для взятия.
Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками,
завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют
(см. п. 3) и помещают в рефрижератор при температуре +4ш С.
3. Маркировка
На флаконы со стандартными эритроцитами наклеивают этикетки с
указанием: учреждения, изготовившего эритроциты, группы крови по
системе АВО, антигенного состава эритроцитов, срока годности.
Наставление по применению стандартных эритроцитов прилагается при
выдаче (см. п. IV).
4. Контроль
Контроль специфичности и активности стандартных эритроцитов
производится после их расфасовки и маркировки в
изоиммуннологической лаборатории станции переливания крови.
5. Хранение и сроки годности
Стандартные консервированные эритроциты хранят при +4ш С. Срок
годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца.
При использовании в качестве стандартных эритроцитов цельной
консервированной крови, а также эритроцитной массы в комбинации с
другими гемоконсервантами, срок хранения стандартов 1-4 недели.
III. ТРАНСПОРТИРОВКА СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
Транспортировка стандартных эритроцитов производится
аналогично транспортировке консервированной крови в изотермической
таре.
IV. НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
КОНСЕРВИРОВАННЫХ СТАНДАРТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ
(прилагается при выдаче)
Консервированные стандартные эритроциты используют в
постановках реакций в различных методиках в соответствии с
действующими инструкциями по изосерологии.
1. Стандартные эритроциты группы О(I) с содержанием в
эритроцитах клинически значимых антигенов D, C, Cw, c, E, e, K, k,
Fy, Jk, M, N, S, s, Le предназначены для выявления соответствующих
изоиммунных противоэритроцитарных антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине, непрямой пробе Кумбса, реакции агглютинации в солевой
среде в пробирках или на плоскости.
Для желатинового метода используют осадок стандартных
эритроцитов или 10% их взвесь в желатине для чего к одной части
осадка эритроцитов добавляют девять частей 10% раствора желатина,
стандартизованного для серологических исследований. В реакции
используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных
эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на
следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и
реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные
эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором
хлористого натрия.
2. Стандартные эритроциты группы О(I), А1(II), А2(II), В(III)
предназначены для выявления изогемагглютининов альфа и бета в
сыворотке или плазме крови при определении групповой
принадлежности крови перекрестным методом, а также для выявления
неполных изоиммунных альфа и бета антител в сыворотке крови
доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в
желатине и непрямой пробе Кумбса. Для перекрестного метода и
реакции конглютинации в желатине применяют неотмытые стандартные
эритроциты взятые непосредственно из осадка со дна флакона. Для
желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или
10% их взвесь в желатине для чего к одной части осадка эритроцитов
добавляют девять частей 10% раствора желатина, стандартизованного
для серологических исследований. В реакции используют по две капли
(0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине
используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую
порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой
среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз
физиологическим раствором хлористого натрия.
3. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов -
два месяца.
Стандартные эритроциты из разгерметизированного флакона
пригодны для использования в течение недели.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
