Медицинское законодательство
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
9 января 1998 г. N 2
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИЙ ПО ИММУНОСЕРОЛОГИИ
В целях совершенствования системы обеспечения иммунологической
безопасности переливания крови и ее компонентов, профилактики
посттрансфузионных реакций и осложнений
ПРИКАЗЫВАЮ:
I. Ввести в действие с 01.02.98:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при
переливании крови (приложение 1).
2. Инструкцию по изготовлению стандартных
изогемагглютинирующих сывороток для определения группы крови
системы АВО (приложение 2).
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при
помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (приложение 3).
4. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и
анти-АВ диагностических жидких для определения группы крови
системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)
(приложение 4).
5. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и
реагента антирезус (приложение 5).
6. Инструкцию по удалению из сывороток антирезус антител
другой специфичности (приложение 6).
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови
(приложение 7).
8. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели (приложение 8).
9. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического
жидкого для определения D антигена системы резус (антитела
моноклональные анти-D) (приложение 9).
10. Инструкцию по применению анти-D IgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности (цоликлона анти-D
супер) (приложение 10).
11. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител (приложение 11).
12. Инструкцию по изготовлению редких сывороток,
предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов
человека (приложение 12).
13. Инструкцию по применению цоликлона анти-С моноклонального
для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека
(цоликлон анти-С супер) (приложение 13).
14. Инструкцию по применению цоликлона анти-Е моноклонального
для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека
(цоликлон анти-Е супер) (приложение 14).
15. Инструкцию по предупреждению посттрансфузионных
осложнений, обусловленных факторами Kell и c(hr') (приложение 15).
16 Инструкцию по иммунизации доноров для получения сыворотки и
иммуноглобулина антирезус (приложение 16).
17. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов
(приложение 17).
18. Инструкцию по определению иммунных антител групповой
системы АВО (приложение 18).
19. Инструкцию по изготовлению консервированных стандартных
эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях
(приложение 19).
2. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов
Российской Федерации обеспечить неукоснительное применение
утвержденных инструкций.
3. Управлению организации медицинской помощи населению,
Управлению охраны здоровья матери и ребенка обеспечить контроль за
своевременным внедрением в практику и качеством проведения
иммуносерологических исследований.
4. Считать недействующими на территории Российской Федерации:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при
переливании крови, утвержденную Минздравом СССР 05.12.90
N 05-14/37-14.
2. Инструкцию по изготовлению стандартных
изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови
системы АВО, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/26.
3. Инструкцию по определению групп крови системы АВО при
помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток, утвержденную
Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/27.
4. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/28.
5. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус
антител другой специфичности", утвержденную Минздравом СССР
27.11.90 N 10-11/136.
6. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови,
утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/29.
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели, утвержденную
Минздравом СССР 06.12.90 N 05-14/38-14.
8. Инструкцию по применению цоликлона анти-D
диагностического жидкого для определения D антигена системы Резус
(антитела моноклональные анти-D), утвержденную Минздравом СССР
21.08.90.
9. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/30.
10. Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких
групп, предназначенных для определения различных изоантигенов
эритроцитов человека, утвержденную Минздравом СССР 26.03.79
N 06-14/3.
11. Методические рекомендации "Иммунизация доноров для
получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденную
Минздравом СССР 27.11.90 N 10-11/138.
12. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов,
утвержденную Минздравом СССР 14.10.76 N 06-14/1.
13. Методические рекомендации "Определение иммунных антител
групповой системы АВО", утвержденные Минздравом СССР 27.11.90
N 10-11/135.
5. Считать утратившими силу:
1. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и
анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови
человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В,
анти-АВ), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
2. Инструкцию по применению анти-Rhо(D) lgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности крови человека
(цоликлона анти-D супер), утвержденную Минздравмедпромом России
14.07.94.
3. Инструкцию по применению цоликлона анти-rh'(С)
моноклонального для определения антигена С системы Резус на
эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер), утвержденную
Минздравмедпромом России 17.03.95.
4. Методические рекомендации "Способ выявления иммунных
анти-А, анти-В антител в сыворотке крови человека", утвержденную
Минздравом РСФСР 15.09.89.
6. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на
заместителя Министра Стародубова В.И.
Министр
здравоохранения
Российской Федерации
Т.Б.ДМИТРИЕВА
Приложение N 1
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ НЕСОВМЕСТИМОСТИ
ПРИ ПЕРЕЛИВАНИИ КРОВИ
I. ВВЕДЕНИЕ
1. Общие сведения.
Основным принципом предупреждения гемотрансфузионных
осложнений является обеспечение совместимости крови донора и
реципиента.
Прежде чем приступить к переливанию крови, врач должен
предусмотреть, чтобы кровь доноров была совместима с кровью
реципиента.
Под совместимостью понимается благоприятное сочетание крови
донора и реципиента. Биологически невозможное их сочетание по
антигенам и антителам различных групповых систем определяет
несовместимость крови донора и реципиента.
В настоящее время известно более 11 групповых систем крови
человека, но значение их в переливании крови неравноценно. В
первую очередь совместимость при переливании крови должна быть
обеспечена правильным выбором донора по группам крови системы АВО
и резус-антигену D.
2. Группы крови АВО.
Наибольшее значение для обеспечения совместимости при
переливании крови имеет выбор крови по системе АВО.
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания
антигенных свойств эритроцитов, называемых агглютиногенами, и
антител по отношению к ним - агглютининов, находящихся в плазме
крови людей.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В и два групповых
агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств
образуют четыре группы крови:
+----------------+----------------+--------------+--------------+
| |Агглютиногены | Антитела | Частота |
| Обозначение |в эритроцитах | в плазме |встречаемости |
| | | | в процентах |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|О альфа бета (I)| нет |анти-А(альфа) | 33,5 |
| | |анти-В(бета) | |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|А бета (II) | А |анти-В(бета) | 37,8 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|В альфа (III) | В |анти-А(альфа) | 20,6 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
| АВо (IV) | А, В | нет | 8,1 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
Агглютинин А (альфа) является антителом по отношению к
агглютиногену А, а агглютинин В (бета) является антителом по
отношению к агглютиногену В. Ошибочное переливание иногруппной
крови, содержащей агглютиногены, против которых у больного имеются
антитела, т.е. крови, содержащей агглютиноген А, при наличии у
реципиента агглютининов альфа (анти-А) или крови, содержащей
агглютиноген В, при наличии у реципиента агглютинина бета
(анти-В), приводит к явлению несовместимости.
3. Система Резус (Rh-Hr).
Кроме антигенов системы АВО в эритроцитах людей имеется
множество других антигенов, образующих различные групповые
системы, независимые как от системы АВО, так и друг от друга.
Наиболее важное значение при переливании крови, после групп
крови АВО, имеют антигены системы резус D, C, E, с, е, Cw,
особенно обладающий наибольшей активностью антиген D, называемый
резус-фактором.
Эти антигены, находясь в эритроцитах людей в различных
сочетаниях, образуют 28 фенотипов (см. "Инструкцию по определению
резус-принадлежности крови").
Так же, как и антиген D, любой другой фактор этой системы
может вызвать образование изоиммунных антител у лиц, его не
имеющих, однако значительно реже и, большей частью, лишь как
сопутствующих антителам против антигена D.
Главным отличием системы резус от системы АВО является то, что
в крови людей содержатся только агглютиногены этой системы, а
антител по отношению к ним, подобных антителам альфа и бета
системы АВО, обычно, в норме у людей не имеется.
Однако у резус-отрицательных лиц при некоторых условиях (при
переливании или при другом способе введения резус-положительной
крови или во время беременности женщины резус-положительным
плодом) может произойти сенсибилизация, т.е. могут образоваться
изоиммунные антитела антирезус.
Последствием этой сенсибилизации у беременной женщины является
рождение детей с гемолитической болезнью или внутриутробная смерть
плода. Поэтому наличие у женщин такого анамнеза, так же как
сведения о трансфузионных реакциях как у женщин, так и у мужчин,
уже указывают на возможное наличие у них резус-антител.
Если больному, в крови которого имеются резус-антитела,
ошибочно перелить резус-положительную кровь, то это приведет к
явлению несовместимости.
Лиц, в крови которых содержится резус-антиген D, т.е.
резус-положительных (Rh+), около 85%.
15% людей являются резус-отрицательными (rh-). (Вычислено
среди лиц русской национальности).
4. Значение других групповых систем эритроцитов при
переливании крови.
Антигены других групповых систем также обладают активностью, в
первую очередь Келл (K), Даффи (Fy), Кидд (Jk), затем антигены
системы MNSs и другие.
Однако антигенная активность их значительно ниже и антитела по
отношению к ним встречаются редко.
Антитела ко всем этим антигенам могут образоваться у человека
любой группы системы АВО, а также, кроме антител анти-D,
независимо от резус-принадлежности, т.е. как у
резус-отрицательных, так и у резус-положительных лиц. Образуются
они при тех же условиях, что и антитела анти-D, т.е. при повторном
введении крови и беременностях, и могут служить причиной
заболевания новорожденного или трансфузионного осложнения.
5. Причины несовместимости и меры ее предупреждения.
Если реципиенту, в крови которого имеются антитела, перелить
кровь донора, эритроциты которого содержат антигены, против
которых направлены эти антитела, такая кровь будет разрушаться в
организме реципиента, т.е. она является для него несовместимой.
Перед переливанием крови врач должен убедиться в том, что
предназначенная для переливания кровь не содержит антигенов,
против которых в крови больного имеются антитела, т.е. совместима
с кровью реципиента.
Для того, чтобы не допустить переливания несовместимой крови и
следующих за этим клинических проявлений несовместимости, врач,
переливающий кровь, обязан:
- правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО;
- правильно выбрать кровь в отношении резус-принадлежности;
- проверить всю относящуюся к этому документацию;
- произвести контрольные исследования, включающие пробы на
совместимость.
Врач должен также учесть, что кроме нормально существующих
антител системы АВО - альфа и бета и имеющих большое практическое
значение изоиммунных антител антирезус-D у реципиента, хотя и
значительно реже, могут встретиться антитела к другим антигенам
эритроцитов: С, Е, с, е, Сw, K, Fy, Jk, M, N, S, s и др.
Предупреждению несовместимости по отношению к этим антигенам,
так же как и в отношении антигена D должно, в первую очередь,
служить тщательное выявление трансфузионного и акушерского
анамнеза. Кроме того, несовместимость к некоторым из них может
быть установлена при проведении проб на совместимость.
6. Выбор крови, совместимой в отношении групп крови АВО (см.
рис. 1).<*>
--------------------------------
<*> - Рисунки не приводятся.
Вопросы совместимости в отношении групп системы АВО решаются
различно в зависимости от того, переливается ли цельная кровь или
предполагается использовать эритроциты, освобожденные от плазмы
(отмытые, размороженные).
а) при переливании цельной крови она должна быть одноименной
по группам АВО, т.е. реципиенту может переливаться кровь той же
группы, к которой принадлежит он сам. При переливании цельной
крови детям это правило является обязательным.
При переливании крови взрослым реципиентам в исключительных
случаях допускается переливание крови группы 0 (I) реципиентам
другой группы, однако количество переливаемой крови в этих случаях
должно быть ограничено.
Эти ограничения связаны с тем, что групповые антитела у
доноров группы 0(I), особенно агглютинины альфа (анти-А), иногда
носят иммунный характер, бывают очень активными и поэтому могут
вызывать разрушение эритроцитов крови реципиента другой группы;
б) при использовании эритроцитов, освобожденных от плазмы
(отмытых, размороженных), эритроциты группы 0(I) являются как бы
универсальной трансфузионной средой и могут быть перелиты
реципиенту любой группы. Реципиенты группы АВ (IV), в крови
которых не содержится групповых антител, являются как бы
универсальными реципиентами и им могут быть перелиты эритроциты
любой группы крови, освобожденные от плазмы.
7. Выбор крови, совместимой в отношении резус-антигена D.
Кроме групп системы АВО, при переливании крови должна
учитываться резус-принадлежность донора и реципиента. Переливаемая
кровь должна быть одноименной с кровью реципиента в отношении
резус-принадлежности.
Это особенно важно для резус-отрицательных реципиентов,
независимо от наличия или отсутствия у них резус-антител, в
последнем случае для предупреждения возможного их образования.
При переливании эритроцитов, освобожденных от плазмы,
резус-положительным новорожденным с гемолитической болезнью,
рекомендуется введение резус-отрицательных эритроцитов.
8. Проверка документации.
Выбрав кровь для переливания больному, специалист обязан:
а) сравнить запись определения группы крови реципиента по
системе АВО (в истории болезни) и донора (на контейнере с кровью,
приготовленной для переливания) и убедиться, что, согласно этим
записям, кровь донора совместима с кровью реципиента в отношении
групп крови системы АВО;
б) проверить запись о резус-принадлежности в истории болезни
реципиента и на контейнере с кровью и убедиться, что кровь донора
и реципиента совпадают по резус-принадлежности.
После проверки документации необходимо сделать контрольные
исследования.
9. Контрольные исследования.
Независимо от проведенных исследований и имеющихся записей
непосредственно перед тем, как приступить к переливанию крови,
СПЕЦИАЛИСТ ОБЯЗАН:
а) определить групповую принадлежность крови больного и
сверить результат с записью в истории болезни и с обозначением
группы крови донора на контейнере (флаконе);
б) определить групповую принадлежность крови донора, взятой из
флакона (из трубочки контейнера), и сверить результат с записью на
нем;
в) произвести пробу на совместимость по группам крови АВО (см.
разделы I и III);
г) произвести пробу на совместимость по резус-антигену D (см.
разделы I, IV, V, VI).
II. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПРОБАХ НА СОВМЕСТИМОСТЬ
ПЕРЕЛИВАЕМОЙ КРОВИ
1. Порядок исследования.
Пробы на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D
проводятся отдельно и не могут заменить друг друга, так как
антитела разного характера требуют разных методов для своего
выявления.
Для проб на совместимость используется сыворотка крови
реципиента и консервированная кровь или эритроцитарная масса
донора.
Если больному переливается кровь из нескольких флаконов
(контейнеров), пробы на совместимость должны быть сделаны с кровью
из каждого флакона (контейнера), даже если на них обозначено, что
кровь получена от одного и того же донора.
Сыворотка больного должна быть свежей, полученной в тот же
день, когда делается переливание крови, или накануне при условии
сохранения ее при температуре 4-8ш С. Исключением являются сроки
взятия сыворотки для проведения пробы на совместимость у больных с
гемотрансфузионными осложнениями (см. раздел VII, п. 9).
2. Получение сыворотки больного и крови донора.
Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови без
стабилизатора в пробирку, на которой надписывают фамилию и
инициалы реципиента, группу его крови и дату. При этом врач должен
лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и
относятся к тому больному, у которого взята эта кровь.
Через 1-2 минуты пробирку с кровью сильно встряхивают для
отделения свертка от стенок пробирки или обводят его сухой
стеклянной палочкой.
После ретракции свертка от него отделяется сыворотка, которая
и служит для пробы на совместимость.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: если необходимо ускорить отделение
сыворотки, пробирку с кровью центрифугируют около 5 мин. при
2000-3000 об/мин.
Кровь донора получают из контейнера, который подготовлен
для переливания. Для этого кровь выпускают через иглу в небольшом
количестве (5-10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой
будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывают
фамилию, инициалы донора, группу его крови и номер контейнера. При
этом врач должен лично убедиться в том, что на пробирке
(пластинке) правильно написаны все сведения о доноре, имеющиеся на
контейнере, из которого получена эта кровь.
3. Характеристика антител системы АВО и условия проведения
пробы на совместимость по группам крови АВО.
Антитела системы АВО - альфа и бета - являются врожденными у
человека. Они представляют собой агглютинины, вызывающие
склеивание несовместимых эритроцитов в прямой реакции между
сывороткой и эритроцитами. Эта реакция хорошо протекает на
плоскости при температуре около 20ш и поэтому при этих же условиях
производится проба на совместимость по группам крови АВО.
4. Характеристика резус-антител.
В отличие от нормальных естественных антител системы АВО
антитела антирезус, так же как и другие аллоиммунные антитела, не
являются врожденными, а появляются в крови у человека лишь
вследствие изоиммунизации и отличаются от антител системы АВО, в
частности, тем, что требуют других условий для своего выявления.
Антиэритроцитарные антитела бывают разной формы: полные и
неполные. Полные антитела активны при проведении реакции в солевой
среде при температуре 37ш; неполные проявляют свое действие в
других условиях, которыми являются: проведение реакции в нативной
сыворотке с подогревом, добавлением различных коллоидов или других
реактивов.
5. Способы выявления резус-антител и выбор методики для
проведения пробы на совместимость по резус-антигену D.
Ввиду того, что при сенсибилизации к резус-антигену D в
подавляющем большинстве случаев образуются неполные антитела, а
полные антитела образуются редко и почти всегда вместе с
неполными, в лечебной практике обычно используются для пробы на
совместимость те реакции, которые выявляют именно неполные
антитела. Такими пробами являются:
а) проба с применением полиглюкина (раздел IV);
б) проба с применением желатина (раздел V);
в) непрямая проба Кумбса (раздел VI);
г) проба на плоскости при температуре 48ш С (раздел VII).
Все перечисленные пробы выявляют неполные резус-антитела и
поэтому в лечебной практике для определения совместимости можно
пользоваться любой из них, однако наиболее чувствительными
являются непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина.
Кроме резус-антител эти пробы выявляют и многие неполные
изоиммунные антитела другой специфичности. Поэтому непрямая проба
Кумбса и проба с применением желатина особенно рекомендуются как
проба на совместимость при переливании крови больным, перенесшим
трансфузионную реакцию, и другим сенсибилизированным лицам,
чувствительным к введению чужих эритроцитов, хотя и совместимых по
группе крови системы АВО и по резус-принадлежности<*>.
--------------------------------
<*> - Примечание: при проведении проб на совместимость по
резус-антигену D следует учитывать, что если резус-отрицательному
больному будет ошибочно выбрана резус-положительная кровь, это
может быть выявлено только в том случае, если у реципиента имеются
в крови резус-антитела. Выявить различие в резус-принадлежности
крови донора и реципиента, если последний не имеет антител, пробы
на совместимость не могут.
Предупреждение таких ошибок должно быть обеспечено
предварительным определением резус-принадлежности крови донора и
реципиента и тщательной проверкой записей результатов в истории
болезни и на контейнере с кровью.
III. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ
ПО ГРУППАМ КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
Проба на совместимость по группам крови АВО производится в
течение 5 минут, на плоскости, при комнатной температуре.
Техника.
Для исследования следует использовать белую фарфоровую или
любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью. На
пластинке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного,
фамилию, инициалы и группу крови донора и номер контейнера с
кровью.
На пластинку накапать 2-3 капли сыворотки больного и туда же
добавить маленькую каплю крови донора так, чтобы соотношение крови
и сыворотки было приблизительно 1:10 (для удобства рекомендуется
сначала спустить через иглу несколько капель крови донора на борт
пластинки, а затем оттуда концом сухой стеклянной палочки
перенести маленькую каплю крови для перемешивания с сывороткой
больного).
Кровь размешать с сывороткой сухой стеклянной палочкой,
пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в покое и
снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом
реакции в течение 5 минут.
Оценка результата.
Если в смеси сыворотки больного и крови донора наступила
агглютинация эритроцитов - агглютинаты видны сначала в виде
мелких, затем крупных комочков на фоне полностью или почти
полностью обесцвеченной сыворотки - это значит, что кровь донора
несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если смесь крови донора и сыворотки больного по истечении 5
минут остается гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации,
то это означает, что кровь донора совместима с кровью больного в
отношении групп крови системы АВО.
Следует помнить, что при несовместимости по группам крови АВО
агглютинация наступает обычно в течение первой минуты, но при
низком титре антител у больного, а также при слабо выраженной
активности агглютиногена у донора (например, подгруппа А2),
агглютинация может наступить значительно позже, иногда только к
концу 5-й минуты.
При некоторых патологических состояниях, например, при ожогах,
циррозах печени, при септико-пиемических состояниях, сыворотка
больных приобретает свойство вызывать неспецифическое склеивание
эритроцитов в так называемые монетные столбики, симулирующие
агглютинацию, поэтому выбор совместимой крови таким больным бывает
затруднен.
В этих случаях следует вновь проверить групповую
принадлежность крови донора и больного и, если в этом отношении не
было ошибки и кровь выбрана правильно, проверить результат пробы
на совместимость микроскопически при подогревании и добавлении
изотонического раствора NaCl. Для этого снова произвести пробу и,
если при микроскопии видны не агглютинаты из эритроцитов, а
"монетные столбики", и при последующем добавлении 2-3 капель
изотонического раствора NaCl и подогревании до 37 ш С они
расходятся и эритроциты располагаются в виде гомогенной взвеси -
можно считать кровь донора совместимой в отношении групп крови
системы АВО.
После того, как установлена совместимость по группам крови
системы АВО, врач должен убедиться, что кровь донора совместима с
кровью больного также в отношении резус-антигена D, для чего
произвести еще одну из проб на совместимость: пробу с 33%-ным
раствором полиглюкина (раздел IV), пробу с применением желатина
(раздел V) или непрямую пробу Кумбса (раздел VI), пробу на
плоскости при температуре +48ш С (раздел VII).
IV. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ
С ПРИМЕНЕНИЕМ 33% РАСТВОРА ПОЛИГЛЮКИНА
Проба проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут.
Для пробы применяется 33%-ный раствор полиглюкина, приготовленный
специально для лабораторных целей.
Техника.
Для исследования использовать центрифужную или любую другую
пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы, группу крови
больного и донора, номер контейнера с кровью.
На дно пробирки пастеровской пипеткой внести 2 капли сыворотки
больного, одну каплю донорской крови, одну каплю 33% раствора
полиглюкина и перемешать содержимое путем встряхивания.
Пробирку наклонить почти до горизонтального положения, затем
медленно поворачивать таким образом, чтобы содержимое ее
растекалось по стенкам. Такое растекание содержимого пробирки по
стенкам делает реакцию более выраженной.
Контакт эритроцитов с сывороткой больного при поворачивании
пробирки следует продолжать не менее 3 минут. Через 3-5 мин. в
пробирку долить 2-3 мл изотонического раствора NaCl и перемешать
содержимое путем 2-3-х кратного перевертывания пробирки. (Не
взбалтывать!)
Оценка результата.
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов в виде
взвеси мелких или крупных комочков иногда хлопьевидной формы на
фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости, это
значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не
должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в
нем не наблюдается признаков агглютинации эритроцитов, это значит,
что кровь донора совместима с кровью больного в отношении
резус-антигена D.
V. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ С ПРИМЕНЕНИЕМ
10% РАСТВОРА ЖЕЛАТИНА
Проба производится в пробирке при температуре 46-48ш С в
течение 10-15 минут.
Техника.
Для исследования использовать центрифужную или любую другую
пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови
больного и донора, и номер контейнера с кровью.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: для удобства рекомендуется сначала выпустить
из флакона через иглу несколько капель крови донора в другую
пробирку, а затем оттуда пастеровской пипеткой перенести маленькую
каплю в пробирку.
На дно пробирки при помощи пипетки поместить одну маленькую
каплю эритроцитов донора, затем туда накапать две капли
подогретого до разжижения 10% раствора желатина и 1-2 капли
сыворотки больного. Раствор желатина необходимо тщательно
просмотреть перед употреблением. При помутнении или появлении
хлопьев желатин непригоден.
Содержимое пробирки перемешать путем встряхивания и поместить
ее в водяную баню или в горизонтальном положении в термостат при
46-48ш С на 15 мин.
После инкубации долить в нее 5-8 мл изотонического раствора
NaCl, содержимое пробирки перемешать 1-2-кратным перевертыванием
ее и просмотреть на свет невооруженным глазом и затем путем
микроскопирования.
Оценка результата.
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов -
эритроциты видны в виде взвеси мелких, реже крупных комочков на
фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости -
это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не
должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в
нем не наблюдается каких-либо признаков агглютинации, это значит,
что кровь донора совместима с кровью реципиента (см. рис. 3).<*>
--------------------------------
<*> - Рисунок не приводится.
VI. НЕПРЯМАЯ ПРОБА КУМБСА, КАК ПРОБА НА
СОВМЕСТИМОСТЬ ПЕРЕЛИВАЕМОЙ КРОВИ
Непрямая проба Кумбса, как проба на совместимость переливаемой
крови, производится путем инкубации сыворотки больного с
эритроцитами донора в течение 45 минут при 37шС с последующим
отмыванием их, добавлением специального реактива (сыворотки для
пробы Кумбса) и наблюдением в течение 20 мин.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: в этой пробе агглютинация
сенсибилизированных эритроцитов происходит за счет иммунных
антител против белка крови человека, находящихся в сыворотке для
пробы Кумбса. Последняя приготавливается из крови животных,
предварительно иммунизированных сывороткой крови человека.
Техника.
Пробирку с кровью донора долить до верха изотоническим
раствором NaCl и перемешать содержимое путем перевертывания
пробирки. Пробирку центрифугировать около 5 мин. до оседания
эритроцитов, после чего отсосать надстой жидкости и снова
повторить процедуру отмывания эритроцитов.
На другой центрифужной или любой небольшой пробирке надписать
фамилию, инициалы и группу крови больного и донора и номер флакона
с кровью. На дно этой пробирки при помощи пастеровской пипетки
перенести из первой пробирки одну маленькую каплю (0,05 мл)
отмытых эритроцитов донора и добавить к ним 3 капли сыворотки
больного.
Сыворотку перемешать с эритроцитами встряхиванием пробирки,
после чего поставить ее в термостат при 37ш С на 45 минут.
Через 45 минут пробирку вынуть из термостата, долить в нее до
верха изотонический раствор NaCl, перемешать содержимое и
центрифугировать до осаждения эритроцитов. Такое отмывание
произвести 2 раза, а если используется видалевская или еще меньшая
пробирка - 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая отмывную
жидкость.
К отмытым, плотно осевшим, эритроцитам добавить 4-6 капель
изотонического раствора NaCl для получения приблизительно 5%
взвеси эритроцитов.
Одну каплю 5% взвеси эритроцитов перенести на белую фарфоровую
или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью,
добавить туда 1-2 капли сыворотки для пробы Кумбса и перемешать
капли стеклянной палочкой.
Пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в
покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за
ходом реакции в течение 20 минут.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: при несовместимости в непрямой пробе Кумбса
агглютинация обычно наступает в течение первой минуты. Однако
следует помнить, что при низком титре резус-антител (или других
антител) агглютинация может наступить значительно позже, иногда к
концу 20-й минуты.
Оценка результата.
Если добавление сыворотки для пробы Кумбса вызовет
агглютинацию эритроцитов - агглютинаты видны в виде комочков на
просветленном или полностью обесцвеченном фоне - это значит, что
кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему
перелита.
Если взвесь эритроцитов осталась гомогенно окрашенной, без
признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с
кровью больного в отношении резус-антигена D, а также в отношении
других изоантигенов, к которым могли образоваться изоиммунные
антитела неполной формы.
В районах, где до настоящего времени использовалась только
проба на совместимость на чашке Петри, временно допускается
сохранение этой пробы в период перехода на пробы с применением 10%
раствора желатина или 33% раствора полиглюкина или использования
непрямой пробы Кумбса.
VII. МЕРЫ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ НЕСОВМЕСТИМОСТИ ПО ОТНОШЕНИЮ
К ДРУГИМ АНТИГЕНАМ СИСТЕМЫ РЕЗУС И АНТИГЕНАМ ДРУГИХ
СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ. ПОДБОР КРОВИ ДЛЯ
ИЗОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ БОЛЬНЫХ
1. Общие сведения.
Выше было сказано, что, кроме антигенов системы АВО и
резус-антигена D, причиной несовместимости при переливании крови
могут быть другие антигены системы резус или антигены других
систем. Это может произойти в тех случаях, когда кровь
переливается сенсибилизированному больному, имеющему в крови
антитела против этих антигенов.
Для решения вопроса о возможной сенсибилизации больного к
различным антигенам первостепенное значение имеет трансфузионный и
акушерский анамнез. Наличие в анамнезе указаний на возможную
сенсибилизацию (см. п. 4) требует дальнейшего исследования крови
реципиента (см. п. 5) и, если будут найдены антитела, специального
выбора или индивидуального подбора крови (см. п.п. 6, 7). Следует
отметить, что многие изоиммунные антитела выявляются теми же
методами, что и антитела анти-D, некоторые - так же как антитела
системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора в отношении этих
антител может быть выявлена уже при выполнении проб на
совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D.
2. Значение пробы на совместимость по группам крови АВО для
выявления других антител.
В некоторых случаях в крови у людей образуются изоиммунные
антитела анти-М и анти-N. Эти антитела в большинстве случаев
активны в тех же условиях, что и антитела системы АВО, т.е.
вызывают агглютинацию эритроцитов на плоскости при комнатной
температуре. Поэтому, если у больного имеются антитела анти-М или
анти-N, а эритроциты донора содержат эти факторы, то
несовместимость по отношению к ним выявится при пробе на
совместимость по группам крови АВО. Кровь такого донора не должна
быть перелита этому реципиенту.
В таких случаях кровь реципиента необходимо исследовать в
лаборатории на изоиммунные антитела. Предварительно следует
проверить правильность определения группы крови и
резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет
отложить трансфузию до получения результатов исследования
специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь
путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами
крови донора.
3. Значение проб на совместимость по резус-антигену для
выявления других антител.
При проведении проб на совместимость по резус-антигену D можно
выявить также неполные изоиммунные антитела к другим антигенам
системы резус: С, Е, с, е, а иногда и к антигенам других систем
эритроцитов. С этой точки зрения наиболее чувствительными являются
непрямая проба Кумбса и проба с желатином, при помощи которых
выявляются неполные антитела ко всем антигенам системы Резус,
системам Келл-Челлано, Даффи, Кидд и некоторым другим.
Следовательно, если в крови реципиента имеются такие антитела, то
проба Кумбса и проба с желатином выявят несовместимость крови
донора, в которой содержатся эти антигены. Кровь такого донора не
должна быть перелита этому реципиенту.
Для уточнения специфичности антител и выбора совместимого
донора кровь реципиента необходимо исследовать в
специализированных лабораториях. Предварительно следует проверить
правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если
состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения
результатов исследования специфичности антител, следует попытаться
найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с
несколькими образцами крови доноров.
4. Учет трансфузионного и акушерского анамнеза.
Если больной получал трансфузии крови, одноименной или
совместимой по группам крови системы АВО и резус-принадлежности D,
но несмотря на это, трансфузии сопровождались реакциями или
осложнениями, это указывает на возможную сенсибилизацию больного к
другим антигенам системы резус или к антигенам других систем и на
несовместимость для него крови, содержащей эти антигены.
Если женщина имела беременности, закончившиеся рождением детей
с гемолитической болезнью или рождением мертвых плодов, и кровь
этой женщины резус-положительная или резус-отрицательная, но не
содержит антител анти-D, то это также указывает на возможную
сенсибилизацию женщины к какому-либо другому антигену системы
резус или других систем и на несовместимость для нее крови,
содержащей эти антигены.
В таких случаях кровь реципиента должна быть заблаговременно
исследована на наличие изоиммунных антител.
5. Исследование крови на наличие изоиммунных антител.
Определение изоиммунных антител производится специалистами-
серологами в учреждениях службы крови (отделениях, станциях
переливания крови), располагающих стандартными эритроцитами
различной фенотипической структуры. Для этой цели удобно
пользоваться эритроцитами группы 0(I). Среди них должны быть
образцы эритроцитов резус-отрицательные и резус-положительные
различного фенотипа: CcDEe, CcDee, CCDеe, ccDEе, ссDЕЕ, ccDee,
Сcddеe, ccddЕе.
Среди резус-положительных эритроцитов целесообразно иметь
образцы гомозиготные и гетерозиготные по антигенам С и Е, т.е.,
содержащие и не содержащие антигены с и е.
Среди резус-отрицательных эритроцитов следует иметь образцы
различные по антигенам системы Даффи, Келл-Челлано, Кидд. Кроме
того, все стандарты должны быть типированы по системе MNSs, Pp,
Левис и др.
Ввиду того, что изоиммунные антитела могут быть как полной,
так и неполной формы, их следует выявлять, используя разные методы
при различных температурных режимах. Для выявления неполных
антител необходимо проводить непрямую пробу Кумбса или реакции с
использованием коллоидов (желатин, полиглюкин). Для выявления
полных антител проводят реакцию солевой агглютинации при разных
температурах: 37ш, 20ш, 4ш С.
Заключение о наличии, а также о форме и специфичности антител
делают по результатам реакции во всех методах.
Форма антител. Если положительная реакция выявилась с
различными образцами эритроцитов только при проведении непрямой
пробы Кумбса (или реакции с применением желатина или полиглюкина),
это значит, что в исследованной сыворотке содержатся только
неполные антитела.
Если положительная реакция выявилась при непрямой пробе Кумбса
(или в реакции с применением желатина или полиглюкина) и
одновременно в реакции солевой агглютинации, это значит, что в
сыворотке содержатся как неполные, так и полные антитела. Полные
антитела могут быть тепловыми, тогда положительный результат
выявится при температуре 37ш С, или холодовыми, давшими
положительный результат при 20ш С или 4ш С.
Если сыворотка дала положительный результат только в реакции
солевой агглютинации в пробирках, это значит, что она содержит
только полные антитела - тепловые или холодовые (в зависимости от
того, при какой температуре выявилась агглютинация).
Если агглютинация эритроцитов не наблюдается ни в одной из
этих проб, это говорит об отсутствии как полных, так и неполных
изоиммунных антител к антигенам, содержащимся в стандартных
эритроцитах, которые были использованы при этом исследовании.
Специфичность антител устанавливается в зависимости от
результатов реакции со стандартными эритроцитами, содержащими
разные антигены. Это заключение необходимо сделать для полных и
неполных антител в отдельности.
Большую роль при определении специфичности антител может
сыграть определение антигенной структуры эритроцитов самого
больного. Если такое исследование было возможным, то это очень
облегчит решение вопроса о специфичности антител, так как у
больного могут быть антитела только к тем антигенам, которые не
содержатся в его собственной крови.
Неполные антитела в одной и той же сыворотке могут иметь как
одну, так и различную специфичность.
При одновременном присутствии в сыворотке неполных и полных
антител они также могут быть одной или различной
специфичности.
Полные антитела большей частью бывают моноспецифичными.
Таким образом, исследование сыворотки больного с применением
разных методов при наличии стандартных эритроцитов, типированных
по различным изоантигенам, позволяет решить вопрос о характере
иммунизации.
Если у больного выявлены изоиммунные антитела, то, зная их
специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании
крови специальным выбором донора (см. п. 6).
Если у больного выявлены антитела, но определить их
специфичность невозможно, например, из-за недостаточного набора
стандартных эритроцитов, совместимость переливаемой крови можно
обеспечить индивидуальным подбором донора (см. п. 7).
6. Специальный выбор донора.
Специальный выбор донора (донорской крови) производится на СПК
или ОПК в тех случаях, когда установлена форма и специфичность
имеющихся у больного антител, а на СПК или ОПК имеются доноры,
типированные по этим антигенам. Выбор производится из числа лиц
одногруппных по системе АВО и резус-принадлежности.
Если предполагается переливать эритроциты, освобожденные от
плазмы, можно использовать также и разногруппную кровь, но
совместимую в отношении эритроцитов донора.
В этих случаях эритроциты группы 0(I) можно переливать
реципиентам любой группы, а реципиентам группы АВ (IV) -
эритроциты любой группы крови, но в обоих случаях одноименные по
резус-принадлежности.
Далее выбираются доноры, не содержащие в крови антигенов,
против которых у больного обнаружены антитела. После такого
специального выбора донора, эритроциты которого не содержат
антигенов, против которых у больного выявлены изоиммунные
антитела, кровь этого донора следует проверить в пробах на
совместимость с сывороткой больного с обязательным включением того
метода, в котором оказались активными антитела больного. Затем,
при благоприятном результате этих исследований, от донора
заготавливается кровь (или берется кровь, заготовленная от него
ранее) и передается в лечебное учреждение специально для этого
больного.
Несмотря на специальный выбор крови, врач должен перед
трансфузией провести все контрольные исследования, предусмотренные
в разделе 1, 9 и только после этого он может приступить к
переливанию крови, начав его с биологической пробы.
В тех случаях, когда СПК или ОПК не располагают кровью
доноров, типированных как необходимо для конкретного больного,
подбор крови такому сенсибилизированному больному следует
проводить индивидуально.
7. Индивидуальный подбор донора.
Индивидуальный подбор донора (донорской крови) производится по
следующим показаниям:
а) в тех случаях, когда трансфузиолог обнаружил
несовместимость в пробах по группам крови АВО или резус-антигену и
контрольная проверка исключает ошибки в отношении этих антигенов
и если при этом состояние больного позволяет отложить трансфузию,
чтобы дополнительно исследовать кровь на изоиммунные антитела.
Подбор осуществляют, используя ту же реакцию, с помощью
которой обнаружены антитела. Если агглютинация наблюдалась при
проведении пробы на совместимость по группам крови АВО, то подбор
крови следует вести на плоскости при комнатной температуре. Если
агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по
резус-антигену D, то подбор следует проводить, используя непрямую
пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (разделы IV,
V).
Когда будет подобрана кровь, не дающая агглютинации с
сывороткой больного, следует провести с ней все другие реакции,
предусмотренные при переливании. В тех случаях, когда для
переливания подбиралась кровь из флакончиков-спутников, врач
должен повторить все исследования, взяв кровь непосредственно из
контейнера, подготовленного для трансфузии. При отсутствии
признаков несовместимости врач может приступить к переливанию
крови, начав его с биологической пробы.
Следует учесть, что если несовместимость выявлена только по
группам крови АВО, а контрольные пробы исключают ошибку по этим
антигенам, то это чаще всего бывает за счет антител анти-М или
анти-N и подобрать совместимую кровь в этих случаях удается обычно
уже среди 5-6 образцов. Если несовместимость выявилась из-за
наличия неполных антител, подбор может оказаться более трудным,
но все же, если трансфузия срочная, можно попытаться найти
совместимую кровь.
б) индивидуальный подбор проводится также в тех случаях, когда
определены наличие и специфичность изоиммунных антител в крови
больного, но СПК и ОПК не имеет возможности специально выбрать
кровь из-за отсутствия типированного донора с подходящей для
данного больного антигенной структурой. Подбор в этих случаях
проводится с кровью, взятой из флакончиков-спутников, или с
кровью, полученной непосредственно у доноров из пальца. Начинать
подбор следует, используя ту реакцию, в которой оказались
активными изоиммунные антитела. Если выявлены полные антитела, то
следует учитывать и температуру, при которой они оказались
активными.
Вероятность нахождения совместимой крови в таких случаях
зависит от специфичности антител. При антителах с или е подбор
следует вести из числа резус-положительных доноров. При этом
обычно удается довольно быстро найти с-отрицательную кровь (16%),
но значительно труднее е-отрицательную ввиду редкой встречаемости
лиц, не содержащих этого фактора (2,5%).
Большая или меньшая трудность подбора крови при антителах
другой специфичности будет зависеть также от частоты факторов, к
которым направлены антитела. Особенно затруднен подбор бывает при
наличии антител к фактору Челлано, выявленному у 99,85% лиц, а
также в случае сочетания антител разной специфичности.
После такого индивидуального подбора кровь, заготовленная от
доноров, передается в лечебное учреждение для переливания данному
больному.
в) индивидуальный подбор крови донора следует проводить также
в тех случаях, когда у больного выявлены изоиммунные антитела, но
не установлена их специфичность. Это может быть связано с
ограниченностью на СПК (ОПК) образцов стандартных эритроцитов,
типированных по изосерологическим системам, а также, возможно, с
наличием в крови больного антител к неизвестному до этого времени
антигену. Подбор в таких случаях следует проводить, используя
кровь из флакончиков-спутников или кровь, полученную
непосредственно у донора из пальца, начиная его той же реакцией, с
помощью которой оказались активными антитела больного. В таких
случаях решить заранее вопрос, среди каких доноров легче подобрать
кровь, бывает трудно. После такого индивидуального подбора кровь
передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
8. Использование подобранной крови.
Как специальный, так и индивидуальный подбор крови,
производимой на СПК (ОПК), является предварительной процедурой.
Врач-трансфузиолог, получив флакон с кровью, должен во избежание
ошибки сверить паспортные данные на флаконе с данными о крови
больного в истории болезни, произвести контрольные реакции -
определение группы крови больного и донора и пробы на
совместимость. При совпадении группы крови и резус-принадлежности
больного и донора и отсутствии агглютинации в пробах на
совместимость, врач может приступить к переливанию крови, начав
его с биологической пробы.
9. Особенности пробы на совместимость у больных с
гемотрансфузионными осложнениями.
У больных, перенесших гемотрансфузионное осложнение,
происходят характерные серологических сдвиги, заключающиеся в том,
что в период до 10-20-го дня идет нарастание сенсибилизации,
выражающееся в повышении титра антител, послуживших причиной
осложнения, и в появлении антител другой специфичности. После
20-го дня начинается постепенное снижение титра антител и
исчезновение их в порядке, обратном появлению. Поэтому таким
больным в период нарастания сенсибилизации пробу на совместимость
следует проводить с сывороткой, полученной от них непосредственно
в день проведения трансфузии крови или не далее чем накануне. При
переливании крови после 20-го дня, кроме этой пробы, желательно
дополнительно проводить пробу на совместимость с порцией
сыворотки, заготовленной на высоте сенсибилизации (10-20-й день).
Это дает возможность предупредить переливание больному крови,
содержащей антиген, против которого у него совсем недавно имелись
антитела.
VIII. ЗАПИСИ О ВЫБОРЕ КРОВИ И
ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Врач, переливающий кровь, обязан записать в истории болезни:
1) паспортные данные с каждого контейнера с кровью - фамилию и
инициалы донора, группу крови, резус-принадлежность, номер
контейнера и дату заготовки крови;
2) результат контрольной проверки групповой принадлежности
крови больного;
3) результат контрольной проверки групповой принадлежности
крови донора, взятой из контейнера;
4) результат пробы на совместимость по группам крови АВО;
5) метод и результат пробы на совместимость по резус-антигену
D.
Записи скрепляются подписью врача.
IX. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Самыми важными показателями, позволяющими судить о
совместимости переливаемой крови (эритроцитов) являются
совместимость по группе крови системы АВО и совместимость по
резус-антигену D.
Для обеспечения совместимости переливаемой крови необходимо на
основании определения группы крови реципиента и записи в истории
болезни, а также документации на контейнере с кровью, правильно
выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО и
резус-принадлежности (см.раздел I, п.п. 6,7).
Непосредственно перед переливанием крови, независимо от
проведенных ранее исследований и имеющихся записей, врач обязан
снова проверить групповую принадлежность реципиента и крови донора
(раздел I. 9), сделать пробу на совместимость по группам крови АВО
(раздел III) и одну из проб на совместимость по резус-антигену D
(разделы IV, V, VI, VII).
Врач должен предусмотреть возможную несовместимость
по отношению к другим антигенам и принять меры для ее
предупреждения.
Если кровь (эритроциты) донора оказалась несовместимой с
кровью реципиента в пробе на совместимость по группам АВО или в
пробе на совместимость по резус-антигену D, она не должна быть ему
перелита!
Если кровь (эритроциты) донора оказалась совместимой с кровью
реципиента в пробах на совместимость по группам крови АВО и
резус-антигену D и нет указаний на несовместимость по отношению к
другим антигенам - кровь (эритроциты) может быть перелита.
Переливание начинается с биологической пробы.
Ответственным за выполнение перечисленных требований и
обеспечение совместимости при переливании крови является
врач-специалист, переливающий кровь.
"Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании
крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 05 декабря
1990 года N 05-14/37-14, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 2
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ
СЫВОРОТОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются
сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других
жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки
предназначаются для определения групповой принадлежности крови
людей по системе АВО.
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой
прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой
принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке
указывают названия учреждения, изготовившего сыворотку,
специфичность, титр агглютининов и срок годности.
I. ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК
Источниками получения стандартных сывороток служат:
а) кровь, заготовленная без консерванта от донора,
предварительно обследованного и содержащего в крови групповые
антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных
сывороток;
б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или
отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам не
использованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела
с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
в) дополнительный источник - плевральный транссудат,
асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с
титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток.
II. УСЛОВИЯ ПРИГОДНОСТИ СТАНДАРТНОЙ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются
следующие требования:
а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать
определенные групповые антитела - альфа (анти-А), бета (анти-В)
или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической
агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы 0(I).
Сыворотка группы АВ (IV), не содержащая групповых агглютининов, не
должна вызывать агглютинации;
б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых
признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В
в течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы
А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к
эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже,
чем 1:16;
в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия;
г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция,
что не влияет на качество сыворотки;
д) должна быть окрашена: группа А (II) в светло-синий цвет,
группа В (III) - в красный цвет, группа АВ (IV) - в желтый цвет.
е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением
консервирующих средств;
ж) должна иметь точную паспортизацию, т. е. обозначение
групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и
наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны
быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со
стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации
изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также
сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных
проверок ее качества.
III. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАБОТЫ ПО ПРИГОТОВЛЕНИЮ
СТАНДАРТНОЙ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
1. Предварительное определение пригодности крови донора для
изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки
путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем
получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования
производятся заранее в пробной порции крови, полученной
непосредственно от донора в небольшом количестве.
2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или
получение плазмы от донора при помощи плазмафереза.
3. Предварительное определение пригодности плазмы,
предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для
изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки.
5. Сбор остатков крови из флакончиков(пробирок)- спутников в
общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и
предварительное определение пригодности для изготовления
стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости,
плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и
предварительное определение пригодности этого материала для
изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления
из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее:
а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых
агглютининов);
б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию;
в) определение гемолизирующих свойств сыворотки;
г) определение активности сыворотки;
д) скорость наступления агглютинации;
е) титр агглютининов.
8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки.
9. Консервирование сыворотки.
10. Первый контроль сыворотки до розлива.
11. Второй контроль сыворотки до розлива.
12. Фильтрование сыворотки.
13. Окрашивание сыворотки.
14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки.
15. Розлив сыворотки.
16. Паспортизация разлитой сыворотки.
17. Контроль разлитой сыворотки.
IV. МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи
стандартных эритроцитов.
Определение производится на белой фарфоровой или любой другой
белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой
надписываются обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В".
Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной
маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп 0(I),
А(II), и В (III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую
каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение
количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10.
Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой,
пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в
покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат.
Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую
каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1
мл) изотонического раствора NaCl и снова покачивают пластинку.
Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в
каждой капле. При этом возможны четыре варианта:
- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В (III),
но отсутствует с эритроцитами группы 0(I). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и
бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к
группе О альфа бета(I);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы В(III) и
отсутствует с эритроцитами групп О(I) и А(II). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В),
т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе А бета(II);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и
отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А),
т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе В альфа(III);
- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это
указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на
принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ (IV).
2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию.
Эти исследования можно проводить одновременно с определением
групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.
Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов
группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.
Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и
группы О(I) проводят до 20 минут.
Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов
одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает
свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях
учитывают скорость ее наступления и интенсивность.
3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.
Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с
определением групповой принадлежности при помощи стандартных
эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает
их гемолиз, значит сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.
4. Определение скорости наступления агглютинации.
Скорость наступления агглютинации определяют так же, как
групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но
с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов
группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью
секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до
момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по
отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.
5. Определение титра агглютининов.
Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке
приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NaCl. Для
этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят
градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствор NaCl. Затем
в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой
сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем
встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во
вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В
результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до
1:1024.
Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения
сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в
пробирке первое исходное разведение (любое).
Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель
изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом
разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6
пронумерованных точек на пластику: в первую точку 2 капли, во
вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить
изотонический раствор: во вторую точку 1 каплю, в третью - 2
капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5
капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с
последней точки в направлении к первой. Так получают разведения
сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.
При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к
эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное
разведение сыворотки 1:24.
Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и
изотонический раствор NaCl каплями, для чего используют одну и ту
же пипетку.
На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1
мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на
пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени
разведения сыворотки 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024.
Разведения сыворотки можно приготавливать также
непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных
точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл)
испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой
переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой,
получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки
наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов
соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют
агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины
бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.
Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с
сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку
покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова
покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.
Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила
агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут,
принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.
V. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ПРИГОДНОСТИ КРОВИ
ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИЗ НЕЕ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ
Основным показателем пригодности крови донора для изготовления
из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость
наступления агглютинации и титр агглютининов.
Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30
секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с
эритроцитами группы А2.
Титр сыворотки должен быть: для агглютинина альфа не ниже, чем
1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже, чем 1:16 по отношению
к эритроцитам А2 и для агглютинина бета не ниже, чем 1:32 к
эритроцитам В.
При предварительном исследовании непосредственно взятой
пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на
одно разведение выше, ввиду возможного его падения в процессе
обработки и консервирования основной порции крови.
Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови
неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов.
Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию
эритроцитов, позднее, чем через 2 минуты, то это не является
противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства
при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают.
Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2
минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной
сыворотки не следует.
Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно на наблюдается,
но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует.
В этом случае так же, как и при выраженной неспецифической
реакции, донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому
обследованию.
Доноров, кровь которых соответствует требованиям,
предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый
учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления
стандартных сывороток.
VI. ВЗЯТИЕ КРОВИ У ДОНОРА И ОТДЕЛЕНИЕ ОТ НЕЕ СЫВОРОТКИ
Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через
15-30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от
стенки и затем помещают на сутки в холодильник при 4-8ш С.
Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в
другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при
4-8ш С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется еще
некоторое количество сыворотки, которую присоединяют в первой
порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на
100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл
сыворотки.
Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала
на один час в термостат, а затем в холодильник.
Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой
надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя и отчество
донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество
крови и полученной из нее сыворотки, а также результат
исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в
"Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления
стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка см. пункт IX).
Получение сыворотки из крови, оставшейся во флакончиках
(пробирках) - спутниках после взятия ее у доноров.
Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из
флакончиков (пробирок) - спутников. Для этого остатки крови
сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе
надписывают группу крови и дату заготовки.
VII. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ ИЗ ПЛАЗМЫ
При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется
фибрин. Это можно осуществить несколькими способами.
1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл
20% или 6 мл 10% на 100 мл плазмы. Через 30-40 минут во флаконе
образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон
следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым
оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся
сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон.
Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные.
Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова
выпадает сверток фибрина; в этих случаях сыворотку еще раз
переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон.
2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с
титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают,
оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают
в холодильник на 10-14 дней. На паспорте флакона дописывают
сведения о дате и количестве добавленной сыворотки.
За 10-14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме
того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или
неспецифическую агглютинацию эритроцитов.
Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с
тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные
данные.
Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона
на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о
дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал
регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной
сыворотки системы АВО".
Дальнейшая обработка сыворотки (см. пункт IX).
VIII. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ ИЗ ПЛЕВРАЛЬНОГО ТРАНССУДАТА
И АСЦИТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ
В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается
пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости,
последнюю можно использовать для изготовления стандартной
сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По
доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через
воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он
имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как
указано выше.
Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего
сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в
"Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления
стандартной сыворотки системы АВО".
IX. ДАЛЬНЕЙШАЯ ОБРАБОТКА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О ПРИГОДНОСТИ СЫВОРОТКИ, ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ЛЮБЫХ
ИСТОЧНИКОВ
1. Серологические исследования.
В сыворотке определяют:
а) групповую принадлежность (групповые агглютинины);
б) гемолизирующие свойства;
в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию;
г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее
выраженность;
д) титр агглютининов.
Методы исследования (см. пункт IV).
На основании этих исследований делают предварительное
заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями
являются скорость наступления агглютинации и титр антител.
2. Сыворотку предварительно считают пригодной, если она
вызывает агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее, чем
через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее, чем через 1
минуту и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по
отношению к эритроцитам групп А1 и В, и не ниже, чем 1:16 по
отношению к эритроцитам группы А2.
При этом также следят за тем, чтобы сыворотка не имела красной
или бурой окраски.
Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов
ниже, сыворотку считают непригодной.
Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих
свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее
непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (пункт XI).
3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных
в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал
регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной
сыворотки".
X. КОНСЕРВИРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у
донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и
признанную предварительно годной, консервируют.
Наиболее пригодным консервантом является борная кислота,
которую прибавляют из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид
натрия 1 г на 1 мл.
После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок
10-12 дней. За этот срок в ней, с одной стороны, может снизиться
титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз
или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку,
имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить
изотоническим раствором NaCl до титра не ниже 1:64 и
соответственно количеству разводителя добавляют борную кислоту или
азид натрия.
XI. ПЕРВЫЙ КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ ДО РОЗЛИВА И ОЦЕНКА
ПРИГОДНОСТИ ЕЕ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ ОБРАБОТКИ
1. Первый контроль производится через 10-12 дней после
поступления сыворотки, ее предварительного испытания и
консервирования. Он заключается в следующем:
а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е.
сверяют записи на флаконе и в журнале;
б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных
эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на
флаконе и в журнале;
в) одновременно с определением групповой принадлежности
проверяют способность сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не
помутнела и не потемнела ли она;
д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления
агглютинации и титр агглютининов;
е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в
журнал.
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки
делается при следующих условиях: если паспортные записи
произведены правильно, в сыворотке нет признаков инфицирования,
если она не помутнела, не потемнела и обладает достаточной
активностью.
Под достаточной активностью при первом контроле понимают
соответствие требованиям, указанным в разделе II, б при условии,
что титр не только соответствует этим требованиям, но и не
снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными
цифрами.
Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной
для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10-12 дней, после чего
производят второй контроль (см. п. XIV).
При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр
сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32),
сыворотку считают непригодной.
При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения
и помутнения сыворотку считают непригодной.
При первом контроле сыворотки явления неспецифической
агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому
что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с
консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает
сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как при
некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени,
предшествующему второму контролю сыворотки.
XII. УСТРАНЕНИЕ СВОЙСТВА СЫВОРОТКИ ВЫЗЫВАТЬ
НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ АГГЛЮТИНАЦИЮ
Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее
изотоническим раствором NaCl. Это допускается только для сыворотки
групп О(I), А(II) и В(III) и только при высоком титре агглютининов
в ней - не ниже, чем 1:64 - и при этом титре не более, чем
половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему
сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной
кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных
разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах.
Наблюдение проводят в течение 20 мин. После подбора разведения,
устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку.
Если разведение изотоническим раствором NaCl не устраняет
неспецифическую агглютинацию, сыворотку считают непригодной.
Разведение сыворотки группы АВ(IV) не допускается. Сыворотку,
вызывающую хотя бы незначительную неспецифическую агглютинацию,
считают непригодной.
XIII. УСТРАНЕНИЕ ГЕМОЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СЫВОРОТКИ
Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее
прогревают при 56ш С в течение одного часа. Если такое прогревание
не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают
непригодной.
XIV. ВТОРОЙ КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ ДО РОЗЛИВА И ОЦЕНКА ЕЕ
ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ ОБРАБОТКИ
1. Второй контроль производят через 10-12 дней после первого
(приблизительно через 20-24 дня после начала обработки сыворотки)
и проводят так же, как первый контроль (см. раздел XI).
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей
обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи
сделаны правильно, сыворотка не инфицирована, не помутнела, не
потемнела, не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза
эритроцитов и достаточно активна.
Под достаточной активностью при втором контроле понимают
соответствие требованиям, указанным в разделе II, б, при условии,
что титр не только соответствует этим требованиям, но и не
снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле.
В других случаях сыворотку считают непригодной.
XV. СМЕШИВАНИЕ СЫВОРОТОК
Для максимального использования сырья и упрощения контроля за
образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких
порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до
розлива (раздел XIX). Предварительно из каждой порции берут по 1-2
мл сыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр
проверяют еще раз через 2-3 дня и, если он не изменился, то
смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым
номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел
XIV).
XVI. ОКРАШИВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Дополнительным условием, предупреждающим ошибки при
определении группы крови, является окрашивание сывороток.
Окрашивание можно производить до фильтрации, если
предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При
использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после
фильтрации.
Сыворотку группы А(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый)
цвет,
сыворотку группы В (III) - в красный цвет,
сыворотку группы АВ (IV) - в желтый цвет (см. дополнение п.
XXX).
XVII. ФИЛЬТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку,
полученную из крови, взятой непосредственно у донора, обычно
достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку,
полученную из других источников, необходимо фильтровать через
фильтр Зейтца со стерилизующей прокладкой. Такое фильтрование
просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции.
Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение
2).
XVIII. ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ПРИГОДНОСТИ
СЫВОРОТКИ
Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после
ее фильтрования.
Сыворотку считают пригодной, если она:
а) специфична, т.е. содержит агглютинины альфа или бета, или
оба вместе и не вызывает неспецифической агглютинации эритроцитов;
б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в
течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение
одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не
ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем
1:16 по отношению к эритроцитам А2.
Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме
абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (см.
раздел XI, первый контроль и раздел XIV, второй контроль);
в) не оказывает на эритроциты гемолизирующего действия;
г) прозрачная. Допускается небольшая опалесценция;
д) предохранена от инфицирования консервированием;
е) имеет точную паспортизацию.
При соответствии этим требованиям сыворотке присваивается
номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная
изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с
соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной
стандартной сыворотки системы АВО".
XIX. РОЗЛИВ
Сыворотку групп О альфа бета(I), Абета(II) и Вальфа(III)
разливают во флаконы или ампулы по 1-5 мл, сыворотку АВ (IV) - по
0,5 мл.
Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в
одном помещении.
Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают
этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают.
XX. ПАСПОРТИЗАЦИЯ РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ
1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой
сывороткой, должны содержать следующие сведения:
а) название учреждения, в котором изготовлена сыворотка;
б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием
агглютининов;
в) номер серии;
г) титр агглютининов в сыворотке. Титр альфа-агглютинина
указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки
группы О альфа бета (I) указывается титр только одного агглютинина
альфа или бета и из них того, который слабее;
д) срок годности: число, месяц, год;
е) на этикетке наносят по диагонали цветные полосы:
для группы А(II) - две синие,
для группы В (III) - три красные,
для группы АВ (IV) - четыре желтые.
2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя
свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и
срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива.
Форму этикетки - см. Рисунок 1.
3. Сыворотку, разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в
"Журнале для регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО".
+------------------------------+ +--------------------------+
| Наименование учреждения - | | Наименование учреждения -|
| изготовителя | | изготовителя |
+------------------------------+ +--------------------------+
| Изогемагглютинирующая | | Изогемагглютинирующая |
|сыворотка группы Оальфабета(I)| |сыворотка группы Абета(II)|
| АНТИ - (А + В) | | АНТИ - В |
|Серия ..... Титр ....... . | |Серия ..... Титр ........ |
|мл ....... годна до .... . | |мл ....... годна до ..... |
+------------------------------+ +--------------------------+
+-----------------------------+ +---------------------------+
| Наименование учреждения - | | Наименование учреждения -|
| изготовителя | | изготовителя |
+-----------------------------+ +---------------------------+
| Изогемагглютинирующая | | Изогемагглютинирующая |
|сыворотка группы Вальфа (III)| | сыворотка группы |
| АНТИ - А | | АВо (IV) |
|Серия ..... Титр ...... .. | | Серия ..... |
|мл ....... годна до ... .. | | мл ....... годна до ..... |
+-----------------------------+ +---------------------------+
Рис. 1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих
сывороток системы АВО.
На этикетки наносят по диагонали цветные полосы:
- для сыворотки группы Абета (II) - две синие;
- для сыворотки группы Вальфа (III) - три красные;
- для сыворотки группы АВо (IV) - четыре желтые.
Возможно печатать таким же цветом полностью текст этикеток.
XXI. СРОК ГОДНОСТИ СТАНДАРТНОЙ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев
с момента ее розлива.
Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить и при
условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см.
раздел XVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца.
XXII. КОНТРОЛЬ РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ
Контроль разлитой сыворотки производят в пределах срока ее
годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в
лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как
образцы для последующего контроля.
Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и
сохранения ее специфичности и активности.
При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие
требования:
а) отсутствие помутнения, выпадения осадка и потемнения;
б) отсутствие способности вызывать неспецифическую
агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не
позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не
позднее, чем в течение одной минуты;
г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при
втором контроле сыворотки до розлива.
Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота
его не ниже требований, указанных в разделе II, б, то сыворотку
проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не
снижается, сыворотку считают пригодной.
XXIII. МЕТОДИКА ТИТРОВАНИЯ ПРИ КОНТРОЛЕ РАЗЛИТОЙ
СЫВОРОТКИ
При контроле разлитой сыворотки титр можно определять более
простым способом. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим
раствором NaCl соответственно указанному на ней титру. Например,
при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического
раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки.
Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну
каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну
маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных
эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с
сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в
течение пяти минут.
Если за это время появилась агглютинация, значит, титр
сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация не
наступила, значит, титр сыворотки снизился. В этих случаях для
установления величины титра сыворотку титруют вновь, как указано в
разделе IV, 5.
XXIV. БРАК РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ В ПРЕДЕЛАХ УКАЗАННОГО
СРОКА ГОДНОСТИ
Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она не
соответствует предъявляемым требованиям (см. раздел XXII, а, б, в,
г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют.
В учреждения, в которые эта сыворотка была отпущена,
немедленно сообщают по телефону или телеграфом о непригодности
данной серии сыворотки.
Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за
непригодности, ликвидируют так же, как сыворотку этой серии,
оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей.
XXV. ВЫДАЧА СЫВОРОТКИ
Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых
определяют группу крови.
Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп
Оальфа бета(I), Абета(II) и Вальфа(III). Сыворотку группы АВо(IV)
выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех
групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают
инструкцию по использованию (см. п. XXIX, дополнение 1).
XXVI. ХРАНЕНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при
комнатной температуре или в холодильнике при 4-8 ш С. Если
сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть
использована после полного ее оттаивания.
XXVI. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПАСПОРТИЗАЦИИ СЫВОРОТКИ
Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех
сведений о находящейся в нем порции исходного материала, из
которого получается сыворотка, и последовательную запись всех
результатов, полученных при исследовании исходного материала, а
затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля.
Паспортные записи производятся:
а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно
пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и
исследования этой порции сыворотки;
б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой
сывороткой;
в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для
изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО".
XXVIII. ПАСПОРТНЫЕ ЗАПИСИ В ЖУРНАЛАХ
а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для
изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все
сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотке,
включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива
сыворотки.
При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под
новым номером.
Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с
неразлитой сывороткой.
в) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива.
В этот журнал вносят сведения, имеющиеся на этикетке разлитой
сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и
результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же
журнал записывают, куда и сколько было отпущено сыворотки каждой
серии.
Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут
независимо от групповой принадлежности сыворотки.
Дополнение N 1
XXIX. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
(прилагается при выдаче сыворотки)
Техника реакции.
Определение группы крови АВО производится стандартными
изогемагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной
температуре.
Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со
смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у
предварительно надписанного обозначения. Во избежание ошибки при
каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток
каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель
в следующем порядке по горизонтали: Оальфа бета(анти-(А+В)),
Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А).
Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле,
приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с
каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой
стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые
промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.
Результат реакции
Наблюдение за ходом реакции производят при легком покачивании
пластинки в течение пяти минут.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным (+)
или отрицательным (-).
Положительный результат (+) выражается в агглютинации
(склеивании) эритроцитов - агглютинаты видны невооруженным глазом
сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в
более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно
обесцвечивается.
При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно
окрашенной.
Агглютинация наступает обычно в течение 10-30 секунд, однако
наблюдение проводят не менее пяти минут ввиду возможности позднего
наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности
эритроцитов (А2 или А2В).
По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в
эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl для разрушения иногда наступающей ложной
агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том
числе в так называемые монетные столбики.
В тех случаях, когда положительный результат получается со
стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для
исключения неспецифической агглютинации производится
дополнительное контрольное исследование испытуемых эритроцитов со
стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых
агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы
АВо(IV) позволяет учесть положительный результат реакции с
сыворотками Оальфа бета(I) (анти-А+В), Абета(II) (анти-В) и
Вальфа(III) (анти-А) как истинный.
+----------------------------------------+----------------------+
|Изогемагглютинирующие сыворотки группы | |
+----------------------------------------+ Исследуемая кровь |
|Оальфа бета(I) Абета(II) Вальфа(III) | принадлежит к группе |
|Анти-(А+В) Анти-В Анти-А | |
+----------------------------------------+----------------------+
| - - - | О(I) |
| - - - | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + - + | А(II) |
| + - + | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + + - | В(III) |
| + + - | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + + + | |
| + + + | |
| | |
|Контроль с сывороткой группы АВо(IV) | АВ(IV) |
+----------------------------------------+----------------------+
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови
при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие ее.
--------------------------------
Примечание.
1. При использовании сывороток с титром не ниже, чем 1:64,
разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров
и больных одной серией сывороток каждой группы. При повторном и
перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной
серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий,
которые были применены при первичном определении.
2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные
ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп
крови системы АВО".
Дополнение N 2
XXX. ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ КРАСОК ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ
СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК
Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются
следующие красители:
- для сыворотки группы Абета(II) - метиленовая синяя,
бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них,
взятые в равных количествах;
- для сыворотки группы Вальфа(III) - эозин (ВА), эозин натрия
или конгорот;
- для сыворотки группы АВо(IV) - уранин (флуоресцеин
растворимый - динатрий флюоресцеинат).
Краски растворяют в дистиллированной воде или изотоническом
растворе NaCl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл
жидкости). Краситель приготавливают исходя из потребности 50-100
мл и сохраняют для использования.
При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования
соответствующие растворы красок добавляют по 3-5 капель на каждые
100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или
сине-зеленый для группы Абета(II), светло-красный для группы
Вальфа(III) и желтый для группы АВо(IV).
Следует иметь в виду, что иногда при хранении запаянных ампул
на свету синяя краска в сыворотке группы Абета(II) слегка
выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы
(флакона).
Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на
титр и срок их годности.
"Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих
сывороток для определения групп крови системы АВО", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 года
N 05-14/26, считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 3
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО ПРИ
ПОМОЩИ СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК
Введение
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания
антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по
отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В, и два
агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств
образуют четыре группы крови: Оальфа бета(I), Абета(II),
Вальфа(III) и АВо(IV).
Возможны два способа определения группы крови:
1. Определение группы крови при помощи стандартных
изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови
устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из
этого, делают заключение о групповой принадлежности исследуемой
крови.
2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е.
одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих
сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как
и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и
кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают
наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается
сделать переливание крови, определяется сертифицированным
специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки
процедуру взятия крови и определения группы повторяют.
Результат определения группы крови записывается в правом
верхнем углу лицевого листка истории болезни с указанием даты и за
подписью специалиста, производившего определение.
Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным
специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи
стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй
раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом,
т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток (также двух
различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов.
Результат обоих определений записывается на лицевой стороне
донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц,
определявших группу крови.
Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток
с титром не ниже, чем 1:64, разрешается проводить первичное
определение группы крови у доноров и больных одной серией
сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении
можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже,
чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены
при первичном определении.
Специальное оснащение
а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп Оальфа
бета(I), Абета(II), Вальфа(III) и стандартная сыворотка группы
АВо(IV).
б. Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III).<*>
--------------------------------
<*> - Стандартные эритроциты приготавливаются учреждениями
службы крови в консервированном виде. Можно использовать и
нативные свежие стандартные эритроциты, приготовленные малыми
дозами в соответствии с действующей инструкцией по их
изготовлению.
в. Изотонический раствор NaCl.
г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со
смачиваемой поверхностью.
д. Пипетки.
е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания
капель крови и сыворотки.
Подготовительная работа
а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим
освещением при температуре 15-25ш С.
б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив
с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий
сыворотки каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы
Оальфа(I), в средние - сыворотку группы Абета(II) и в правые -
сыворотку группы Вальфа(III). В ампулы опускают сухие чистые
пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы АВо(IV), употребляемую в
качестве дополнительного контроля (см. раздел IV, в). Этот набор
дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NaCl.
в. Для определения группы крови перекрестным способом кроме
стандартных сывороток подготавливают также стандартные эритроциты
групп О(I), А(II) и В(III). Пробирки со стандартными эритроцитами
устанавливают в маленький (на три гнезда) штатив в следующем
порядке: слева - группы О(I), в середине - группы А(II) и справа -
группы В(III).
г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток
подготавливают стаканы с водой и с изотоническим раствором NaCl.
Техника определения группы крови
при помощи стандартных сывороток
а. На левой стороне пластинки надписывают Оальфа
бета[анти-(А+В)], в середине - Абета(анти-В) и справа -
Вальфа(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у
которого определяют группу крови.
Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку
наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки
соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух
различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые
образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо:
Оальфа бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А).
Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после
того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу
с сывороткой, из которой она была взята.
б. Кровь для исследования берут из места укола мякоти пальца
или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл
последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку,
каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой
крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества
стандартной сыворотки, с которой она смешивается).
в. Другой стеклянной палочкой перемешивают каплю крови с
сывороткой группы Оальфа бета[анти-(А+В)] до тех пор, пока смесь
не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой
перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы
Абета(анти-В) и так же поступают с сывороткой Вальфа(анти-А). При
использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду.
Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но
в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать
палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать.
г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на
1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.
Наблюдение за ходом реакции проводят на менее пяти минут. Хотя
агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, наблюдение
следует вести и далее - до пяти минут ввиду возможности более
поздней агглютинации, например, с эритроцитами группы А2(II).
д. По мере наступления агглютинации, но не ранее, чем через
три минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых
наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл)
изотонического раствора NaCl и продолжают наблюдение при
периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов реакции
при определении группы крови
при помощи стандартных сывороток
Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть
положительной или отрицательной.
При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунд
от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным
глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из
склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более
крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка
полностью или почти полностью обесцвечивается.
При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут)
остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней
не обнаруживается никаких агглютинатов.
Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы
должны совпадать.
Результаты с сыворотками трех групп: Оальфа бета[анти-(А+В)],
Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А) могут дать четыре различные
комбинации положительных и отрицательных реакций (см. табл. 1).
а. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию,
т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без
признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит
агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I).
б. Если сыворотки групп Оальфа бета[анти-(А+В)] и
Вальфа(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы
Абета(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит
агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II).
в. Если сыворотки групп Оальфа бета[анти-(А+В)] и
Абета(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы
Вальфа(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит
агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III).
г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию,
это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба
агглютиногена - А и В и принадлежит к группе АВ (IV). Однако в
этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности
исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное
контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV).
Для этого на пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) сыворотки
группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл)
каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после
чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании
пластинки. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле, при наличии
ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп Оальфа
бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А), позволяет
считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе
АВ(IV).
Техника определения группы крови
перекрестным способом при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток и
стандартных эритроцитов
а. Определение группы крови перекрестным способом заключается
в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах
испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых
агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных
эритроцитов.
б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме
стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы
О(I), А(II) и В(III).
в. Кровь для исследования берут из вены или места укола
пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в
покое на 20-30 минут для отделения сыворотки (для лучшего
отделения сыворотки через 3-5 минут следует отделить сверток от
стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой).
г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю
часть которой наносят обозначения слева направо: Оальфа
бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А). На верхнем крае
надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу
крови.
д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку
наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных
изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных
сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6
капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке
слева направо: Оальфа бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и
Вальфа(анти-А).
е. На правую часть пластинки также под соответствующими
обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле
стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: О(I),
А(II) и В(III).
ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают
сыворотку (острожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают
ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные
эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки
эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл)
капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки.
з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с
эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают,
затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически
покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти
минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно
начинается быстро (10-30 секунд).
Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со
стандартными эритроцитами, может наступить поздно (к концу пятой
минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в
исследуемой сыворотке агглютининов.
и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3
минуты, в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной
капле (0,05 мл) изотонического раствора NaCl и продолжают
наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов при определении группы крови
перекрестным способом
Учет реакции производится путем сопоставления результатов,
полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных
эритроцитов (см. табл. 2).
Результаты реакций, полученных при помощи стандартных
сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е.
указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов,
соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут
быть выражены в четырех различных комбинациях.
а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие
групповых агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови
к группе О(I) (см. раздел IV, а). При этом сыворотка исследуемой
крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными
эритроцитами группы О(I) и положительную - с эритроцитами групп
А(II) и В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови
агглютиногенов альфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность
исследуемой крови к группе Оальфа бета(I).
б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV, б). При
этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп О(I) и А(II), но положительную с
эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой
крови агглютинина бета, т.е. подтверждает принадлежность
испытуемой крови к группе Абета(II).
в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
определяется наличие агглютиногена В (раздел IV, в). При этом
сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп О(I) и В(III), но положительную с
эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследуемой
крови агглютинина альфа , т.е. подтверждает принадлежность
испытуемой крови к группе Вальфа(III).
г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
устанавливается наличие агглютиногенов А и В, а исследование с
контрольной сывороткой группы АВ(IV) подтверждает специфичность
реакции (см. раздел IV, г). При этом сыворотка исследуемой крови
дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех
групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой
крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе
АВо(IV).
Причины ошибок и меры их предупреждения
Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным
заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови.
Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок
расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах,
ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное
соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение
времени, необходимого для проведения реакции (5 минут), не
использование контрольной реакции с сывороткой группы АВо(IV),
загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а
также использование недоброкачественных стандартов, например,
сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной),
загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может
вызвать неспецифическую реакцию агглютинации и т.д.
Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к
неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой
отдельной капле. Последнее может заключаться в следующем:
Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не
произошло, в то время как она фактически есть или должна
появиться.
Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла
агглютинация, в то время как она фактически отсутствует.
Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при
фактическом наличии агглютинации, может произойти:
а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или
бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные
сыворотки мало активны, или от того, что эритроциты исследуемого
лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном
наличии этих двух причин агглютинация может совсем не появиться,
например, если малоактивная сыворотка группы Вальфа(анти-А) не
дает агглютинации с эритроцитами группы А(II), если
агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2.
Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции
не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в
которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с
активными сыворотками, агглютинирующая способность которых
проверена, соответствует требованиям инструкции и в пределах срока
ее годности;
б) при избытке крови, если взята слишком большая капля.
Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема
исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных
эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10;
в) при высокой температуре (выше 25ш С) окружающего воздуха,
например, в жаркую погоду (см. раздел II, а).
Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется
группа крови, следует охладить.
Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при
фактическом отсутствии агглютинации, может произойти:
а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные
столбики", которые невооруженным глазом можно принять за
агглютинаты.
Во избежание этой ошибки необходимо добавление изотонического
раствора NaCl (см. раздел III, д) с последующим покачиванием
пластинки,что, как правило, уничтожает "монетные столбики";
б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или
панагглютинации.
Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определения
групп крови при температуре ниже 15ш С (см.раздел II, а) и
обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см.
раздел IV, г);
в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей
неспецифическую агглютинацию.
Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы
(флаконы) со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в
ней имеются помутнение или признаки высыхания;
г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не
покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут
образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию.
Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать
пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III, г и
раздел V, з).
Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной
капле можно сделать неправильное заключение о групповой
принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в
штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по
определению групповой принадлежности следует тщательно проверять
расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а
также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую
принадлежность, номер серии и дату годности.
Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата
необходимо повторное определение группы крови при помощи
стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются
неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных
сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным
способом.
Примечание 1. При определении групповой принадлежности крови
больных в лечебных учреждениях могут встретиться трудности,
вызванные изменением свойств крови при различных патологических
состояниях. Это может выразиться в неспецифической
агглютинабельности эритроцитов, например, при аутоиммунной
гемолитической анемии, у новорожденных с гемолитической болезнью,
у больных циррозом печени, с ожогами, при гнойно-септическом
состоянии. При некоторых заболеваниях, например, при лейкозах,
наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно
группы А(II), а также снижение активности групповых
агглютининов.
В таких случаях определение групповой принадлежности крови
больного должно производиться повторно с использованием
стандартных сывороток более высокой активности, желательно в
лабораторных условиях.
Примечание 2. При использовании для определения групп крови
системы АВО моноклональных антител следует руководствоваться
специальной инструкцией, которая прилагается к комплектам
моноклональных антител при их выдаче.
+--------------------------------------+----------------------+
|Изогемагглютинирующие сыворотки группы| |
+--------------+---------+-------------+ Исследуемая кровь |
|Оальфа бета(I)|Абета(II)| Вальфа(III) | принадлежит к группе |
|Анти-(А+В) | Анти-В | Анти-А | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| - | - | - | О(I) |
| - | - | - | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + | - | + | А(II) |
| + | - | + | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + | + | - | В(III) |
| + | + | - | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + + + | |
| + + + | |
| | |
|Контроль с сывороткой группы АВо(IV) | АВ(IV) |
| - | |
+--------------------------------------+----------------------+
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови
при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие ее.
+--------------------------------------+ +--------------------------------------+
| Изогемагглютинирующие | | Изогемагглютинирующие |
| сыворотки группы | | сыворотки группы |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
|Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III)| |Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III)|
|Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А | |Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
| - | - | - | | + | - | + |
| - | - | - | | + | - | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
| Стандартные эритроциты | | Стандартные эритроциты |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+-----------------+
| О(I) | А(II) | В(III) | | О(I) | А(II) | В(III) |
| - | + | + | | - | - | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+-----------------+
|Исследуемая кровь группы О(I) | |Исследуемая кровь группы А(II) |
+--------------------------------------+ +--------------------------------------+
+--------------------------------------+ +-------------------------------------+
| Изогемагглютинирующие | | Изогемагглютинирующие |
| сыворотки группы | | сыворотки группы |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
|Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III | |Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III|
|Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А | |Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
| + | + | - | | + | + | + |
| + | + | - | | + | + | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
| Стандартные эритроциты | | Стандартные эритроциты |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+----------------+
| О(I) | А(II) | В(III) | | О(I) | А(II) | В(III) |
| - | + | - | | - | - | - |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+----------------+
|Исследуемая кровь группы В(III) | |Исследуемая кровь группы АВ(IV) |
+--------------------------------------+ +-------------------------------------+
Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови
перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.
"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 г. N 05-14/27,
считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 4
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНОВ АНТИ-А, АНТИ-В И АНТИ-АВ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЖИДКИХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ
ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ АВО (АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ
АНТИ-А, АНТИ-В, АНТИ-АВ)
ТУ 9398-205-27575295-94
1. Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для
определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях
гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с
поликлональными иммунными сыворотками.
2. Характеристика и основные свойства цоликлонов
анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя
мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей
анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой
смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология
изготовления реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.
Оловникова, Е.В.Белкина.
3. Техника определения групп крови человека
системы АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в
консервант: в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из
пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: и
на пластине или планшете. Определение группы крови производится в
помещении с хорошим освещением при температуре 15-25ш С.
3.1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными
пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой
капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
3.2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле
исследуемой крови (0,01-0,03 мл).
3.3. Смешайте кровь с реагентом.
3.4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при
легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут.
Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые
3-6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более
позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые
разновидности антигенов А или В.
3.5.Результат реакции в каждой капле может быть положительным
или отрицательным. Положительный результат выражается в
агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны
невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро
сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля
остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней
не обнаруживаются.
3.6. Интерпретация результатов реакции агглютинации
исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
+---------------------------------+---------------------------+
| Результат реакции<*> | |
| с Цоликлоном: | Исследуемая кровь |
+----------+---------+------------+ принадлежит к группе <**>|
| анти-А | анти-В | анти-АВ | |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| - | - | - | О(I) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| + | - | + | А(II) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| - | + | + | В(III) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| + | + | + | АВ(IV) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
--------------------------------
<*> - Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие агглютинации.
<**> - Окончательно АВО принадлежность устанавливается только
по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на
эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
4. Контроль специфичности реакции агглютинации
В составе Цоликлонов нет высокомолекулярных добавок, способных
вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не
требуется проведение контроля с растворителем. При положительном
результате реакции агглютинации со всеми тремя Цоликлонами
необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию
исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну
каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического
раствора. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при
отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
5. Форма выпуска
Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5-10
мл. Цоликлон анти-А - красного цвета, анти-В - синего и анти-АВ -
бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия в
конечной концентрации 0,1%.
6. Хранение
Срок хранения - два года при температуре 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить при температуре 2-8ш С в закрытом виде в
течение одного месяца.
7. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным.
Необходимо также приложить протокол с результатами проверки
реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона с
Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ
диагностических жидких для определения групп крови человека
системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)",
утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома
России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 5
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОК
И РЕАГЕНТА АНТИРЕЗУС
Стандартные сыворотки антирезус служат для определения
резус-принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц,
сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные
резус-антитела.
Источники получения сыворотки антирезус
Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть
получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во
время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные
реакции или осложнения, которым производят кровопускание в
процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же
лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для
переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них
обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально
иммунизированных антигеном резус. (см. Метод. рекоменд.
"Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина
антирезус").
Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену и
содержащих в крови резус-антитела
Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у
женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится
персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь
резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При
выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в
учреждения Службы крови.
Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к
резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких
женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоиммунных
лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских
консультациях и в учреждениях Службы крови.
Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся
резус-антитела
У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может
быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.
Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода.
Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую
психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка.
Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена
сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении
детей с таким же заболеванием.
При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать
состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия
крови.
В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по
окончании периода лактации, желательно привлечение женщин,
иммунизированных во время беременности, к систематическому
донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в
соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации
доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".
Показатели пригодности крови для изготовления из нее
стандартной сыворотки антирезус
Показателем пригодности крови для приготовления из нее
стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр
резус-антител.
Ввиду возможного снижения титра антител при обработке
сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых
содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные
требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных
антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител
при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже, чем 1:128,
а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или
реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.
Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного
универсального реагента должен быть не ниже 1:32.
Методы и дозы взятия крови
Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену
предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от
искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых
соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам,
дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах,
предусмотренных этой инструкцией.
Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать
также методом плазмафереза, однако только вне периода
беременности.
Оплата на усиление питания лицам, из крови которых
изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови
и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в
тройном размере.
Первичная обработка сыворотки и плазмы
При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза
плазма не позже, чем через 2-3 дня, должна быть дефибринирована.
Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон,
добавляют в нее 20% раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100
мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через
несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут флакон
с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и
оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают
в холодильник при температуре 4-8ш С. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной
кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия -
1 г на 1 л.
Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через
несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30
минут флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и
оставляют на 2 ч. при комнатной температуре, после чего помещают в
холодильник при температуре 4-8шС. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком
титре резус-антител можно получить дополнительное количество
сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для
этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают
его до половины объема изотоническим раствором NaСl или сывороткой
группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным
разводителем или альбумином.
Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают
пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше
вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в
холодильник при температуре 4-8ш С. На следующий день
сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике
до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой
сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител.
Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв
соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают
далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из
расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л.
Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NaCl
применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается
последующее использование сыворотки антирезус реакцией
агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией
конглютинации с применением желатина или полиглюкина.
После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4-8 ш С
не менее 2-3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.
Исследование сыворотки
Исследование сыворотки следует производить через 2-3 недели
после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период
может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с
проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО.
Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с
сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка,
полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем
группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител
альфа и бета. Если это будет установлено, то делают
соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в
сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов,
описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител".
Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных
эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы
О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, C
и E, а также два образца резус-отрицательных (ccddee) эритроцитов.
Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и
отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в
сыворотке резус-антител. После этого сыворотку титруют тем же
методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если
сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют
в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в
непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее
титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной
при использовании обоих методов, она титруется также с помощью
двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию
сыворотки на наличие резус-антител").
Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и
исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если
при этом антитела достаточно активны. Активность антител
определяется их титром, который на этом этапе исследования должен
быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в
непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением
желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не
ниже 1:32.
Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4-8ш С еще не менее 2
недель, после чего повторно титруют.
Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус
принадлежит к группе Оальфа бета(I), Абета(II) или Вальфа(III),
для удобства последующего использования ее рекомендуется
абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав
таким образом ее универсальной.
Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или
анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.
После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь
исследуют и титруют, как сказано выше.
Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических
рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности".
Повторное титрование сыворотки
Повторное титрование сыворотки производят, используя метод,
который дал положительный результат при первом исследовании
сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем
на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр,
указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.
Стандартизация сыворотки антирезус
Стандартизация заключается в исследовании специфичности
антител и в определении пригодности ее для практического
использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью
того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в
сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены
резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDee,
Ccddee и ccddEe, и резус-отрицательными - ccddee. В число
резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не
содержащих факторов Даффи (Fy) и Келл (К). Если при стандартизации
сыворотка дает положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной
структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddee, ccddEe
и резус-отрицательными - ссddee, то значит в сыворотке содержатся
резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены
антитела специфичности анти-D, то ее титруют при использовании
того же метода.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с
эритроцитами Ссddee или ccddEe, но дает отрицательный результат с
эритроцитами ccDee и с резус-отрицательными - ccddee, то это
значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или
анти-Е.
Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при
помощи которого они были выявлены.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а
также с эритроцитами Ссddee и ссddEe, но отрицательный результат
со всеми резус-отрицательными эритроцитами ccddee, то это значит,
что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем
антигенам резус, т.е. анти-D+C анти-D+E или анти-D+C+E.
Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при
использовании которых они оказались активными.
Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той
же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть
соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их
титрование следует проводить, используя разные методы.
Если исследуемая сыворотка дала положительный результат
избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в
ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или
анти-Келл.
Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по
изготовлению сывороток редких групп".
Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического
использования, если она содержит одно или несколько резус-антител
в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой
среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для
реакции с применением желатина или полиглюкина
Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается
использование таких сывороток с более низким титром при условии
хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки,
отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками
данной специфичности.
Назначение сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть
использована в зависимости от формы установленных в ней антител:
реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением
желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.
Кроме того, сыворотка, содержащая неполные резус-антитела,
может быть использована для приготовления стандартного
универсального реагента антирезус с применением 33% раствора
полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п.
16).
Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для
практического использования, должны быть расфасованы и
паспортизированы.
Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус
После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки
фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2-5 мл,
в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеиваются
этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии,
обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы
антител антирезус и срока годности.
Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус
Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в
холодильнике при 4-8ш С или в замороженном состоянии при -15ш С и
ниже.
При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет
свойств в течение 2 лет.
При размораживании или хранении ее при 4-8ш С срок годности
устанавливают 4 мес.
Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и
дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть
проверены (см. п. 10) и при сохранении их специфичности и титра
срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном
состоянии - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4-8ш С
- на 2 месяца.
+------------------------------++------------------------------+
| Наименование учреждения- || Наименование учреждения- |
| изготовителя || изготовителя |
| || |
| Сыворотка АНТИРЕЗУС || Сыворотка АНТИРЕЗУС |
+------------------------------++------------------------------+
+------------------------------++------------------------------+
| анти- ..... неполные антитела|| анти- ....... полные антитела|
| для метода ..................|| для метода ..................|
| Группа крови ........ || Группа крови ........ |
| Серия ........ ..... мл || Серия ........ ..... мл |
| Годна до ......... || Годна до ......... |
+------------------------------++------------------------------+
Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.
На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по
диагонали цветные полосы:
для сыворотки группы А(II) - синие;
для сыворотки группы В(III) - красные;
для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной
- желтые.
Выдача стандартной сыворотки антирезус
При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо
приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это
особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по
форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов
исследования, активны только при применении определенного метода и
будут неактивными или неспецифическими при неправильном их
использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см.
дополнения 1, 2, 3.
Изготовление стандартного универсального реагента антирезус
для определения резус-принадлежности в пробирках без
подогрева
Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для
определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой
принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток,
содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных,
исследованных и признанных пригодными как стандартные (см. п.п.
6-11).
Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV)
или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов
альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические
рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности").
Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с
титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более
высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32
изотоническим раствором NaCl, сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным универсальным разводителем (см. Методические
рекомендации "Приготовление сыворотки-разводителя и стандартного
разводителя").
Титрование сывороток производят с применением 33% раствора
полиглюкина.
В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и
т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического
раствора NaCl.
Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли
исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после
перемешивания содержимого, переносят 2 капли во вторую, из третьей
- в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус -
положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33% раствора
полиглюкина.
Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4-6 доноров
группы О(I) резус-положительной, взятой не более, чем за 2-3 дня.
Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем
наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно
поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам
пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании
пробирок продолжают 3 минуты.
Через 3-5 минут во все пробирки добавляют по 2-3 мл
изотонического раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 1-2
кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом
или через лупу.
Оценку результата производят по наличию или отсутствию
агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне
полностью или частично обесцвеченной жидкости.
Последнее разведение, в котором имеется агглютинация
эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.
Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже
1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят
пробный образец реагента.
Изготовление пробного образца реагента антирезус
К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами
добавляют 1 объем 33% раствора полиглюкина, тщательно перемешивают
и далее проводят исследование в отношении специфичности и
активности.
Исследование на специфичность и активность
Пробный образец реагента исследуют с 2-3 образцами
резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными
ccddee группы О(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование
включают эритроциты генотипа Ccddee и ccddEe. Среди
резус-отрицательных должны быть образцы, положительные и
отрицательные по факторам Даффи (Fy) и Келл (К).
Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов
эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2
капли исследуемого реагента и затем, в соответствии с маркировкой,
в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок
тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до
горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как
сказано выше.
Трактовка результата
Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации
эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.
Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с
D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой
отдельной пробирке.
Если агглютинация произошла во всех пробирках с
резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными
образцами и образцами Ссddee и ссddEe - реакция отрицательная,
пробный образец считают специфическим.
Активность пробного образца можно оценивать одновременно с
оценкой специфичности.
Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась
при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и
через 3 минуты после добавления изотонического раствора NaCl
агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью
просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на
предыдущем этапе исследования, не ниже 1:32, реагент считают
пригодным для практического использования.
Изготовление полного объема (серии)
стандартного универсального реагента антирезус
После заключения о пригодности пробного образца можно готовить
стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из
потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же
методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и
делают заключение о его пригодности.
После этого реагент фильтруют, разливают по 2-5 мл во флаконы
или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и
наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего
реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока
годности.
+------------------------------------+
| Наименование |
| учреждения-изготовителя |
+------------------------------------+
| Универсальный реагент антирезус |
| анти- ................. |
|для метода в пробирках без подогрева|
| Серия ......... .......... мл |
| Годен до .............. |
+------------------------------------+
Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального
реагента антирезус.
Хранение и срок годности
Реагент хранят в холодильнике при 4-8ш С.
Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента
контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.
Выдача стандартного универсального реагента антирезус
Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с
33% раствором полиглюкина и с инструкцией по использованию (см.
дополнение 2).
Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента
антирезус
Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных
для разных методов определения резус-принадлежности, а также
реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации
материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки
антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной
сыворотки антирезус".
Дополнение N 1
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ РЕАКЦИЕЙ
С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция с применением желатина пригодна для работы с
сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.
Общие замечания.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.
Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально
приготовленной- универсальной определяют резус-принадлежность в
эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус
группы О(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах
группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы О(I) и
А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы
О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную
пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок
объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов
эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных
и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться.
б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно
маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в
контрольные пробирки - по одной капле (0,05 мл) стандартных
резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных
резус-отрицательных эритроцитов.
в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10%
раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в
теплой воде (46-48ш С). Перед употреблением желатин следует
просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при
потере свойств застудневать при 4-8ш С желатин непригоден.
г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
2-ой ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за
счет аутоантител.
д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48ш С на 15 минут или в
суховоздушный термостат при той же температуре на 30-45 минут.
е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них
доливают 8-10 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне
жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
считают резус-положительными (Rh+), образы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).
Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после
проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и
активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после
просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго
(контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие
агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на
неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител
и, следовательно, положительный результат с сывороткой на
антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции
солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым
изотоническим раствором NaCl, для элюирования с них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо
выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их
несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности, и, по
возможности, сывороткой с полными антителами.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела
анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются
только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих
антигенов, т.е. фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и Сw
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике
реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок
см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОГО УНИВЕРСАЛЬНОГО РЕАГЕНТА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПРОБИРКАХ БЕЗ
ПОДОГРЕВА
(Прилагается при выдаче реагента)
Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит
групповых агглютининов аьфа и бета и поэтому может быть
использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой
группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности
реагента антирезус необходимо одновременно с основным
исследованием ставить контроль, используя стандартные
резус-положительные и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных
эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая
непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых
эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных
исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица,
кровь которого исследуется.
б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора
полиглюкина.
2-й ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например, за
счет аутоантител.
в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят
согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови
(эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и
резус-отрицательные (rh-) эритроциты.
г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки.
Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более
выраженной.
Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивости комплекса
антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду
возможности замедленной реакции при слабовыраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 2-3 - кратного
переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной
(rh-).
Однако эти результаты можно учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и
отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами,
а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во
всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за
счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с
сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку
антирезус с полными антителами или предварительно отмытые
эритроциты теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с
них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой
активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами
в реакции солевой агглютинации.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их на резус-положительных и
резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно
исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В
число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь
которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа
ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится
сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности.
Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в
различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
Дополнение N 3
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИ-D ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
РЕАКЦИЕЙ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с
сывороткой, содержащей полные резус-антитела.
Общие замечания.
Определение резус-фактора следует проводить двумя сериями
стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции
описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием
одной и той же методики-агглютинации в солевой среде.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки по системе АВО.
Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная -
универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности
крови любой группы по системе АВО.
Сывороткой группы О(I) определяют резус-принадлежность только
в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах
группы О(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах
группы О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На
пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от
которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в
пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое
их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего одну
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl. Такую
взвесь употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2-2,5 см с
внутренним диаметром 0,5-0,6 см и с гладким дном округлой формы в
каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для
контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом
бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий
лунки с круглым дном;
б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле
(0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки)
2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой
серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора
NaCl;
в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле
взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;
г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают
втряхиванием и помещают в термостат при 37ш С на 1 час. (Можно
затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1-2 часа
до учета результатов).
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в
контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над
источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при
положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
- резус-положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).
Однако результаты можно учитывать как истинные только при
совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой
активности. Антиген крови Du в реакции солевой агглютинации не
выявляется.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С
и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е.
фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/28, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Медицинское законодательство
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
9 января 1998 г. N 2
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ИНСТРУКЦИЙ ПО ИММУНОСЕРОЛОГИИ
В целях совершенствования системы обеспечения иммунологической
безопасности переливания крови и ее компонентов, профилактики
посттрансфузионных реакций и осложнений
ПРИКАЗЫВАЮ:
I. Ввести в действие с 01.02.98:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при
переливании крови (приложение 1).
2. Инструкцию по изготовлению стандартных
изогемагглютинирующих сывороток для определения группы крови
системы АВО (приложение 2).
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при
помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (приложение 3).
4. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и
анти-АВ диагностических жидких для определения группы крови
системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)
(приложение 4).
5. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и
реагента антирезус (приложение 5).
6. Инструкцию по удалению из сывороток антирезус антител
другой специфичности (приложение 6).
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови
(приложение 7).
8. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели (приложение 8).
9. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического
жидкого для определения D антигена системы резус (антитела
моноклональные анти-D) (приложение 9).
10. Инструкцию по применению анти-D IgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности (цоликлона анти-D
супер) (приложение 10).
11. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител (приложение 11).
12. Инструкцию по изготовлению редких сывороток,
предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов
человека (приложение 12).
13. Инструкцию по применению цоликлона анти-С моноклонального
для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека
(цоликлон анти-С супер) (приложение 13).
14. Инструкцию по применению цоликлона анти-Е моноклонального
для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека
(цоликлон анти-Е супер) (приложение 14).
15. Инструкцию по предупреждению посттрансфузионных
осложнений, обусловленных факторами Kell и c(hr') (приложение 15).
16 Инструкцию по иммунизации доноров для получения сыворотки и
иммуноглобулина антирезус (приложение 16).
17. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов
(приложение 17).
18. Инструкцию по определению иммунных антител групповой
системы АВО (приложение 18).
19. Инструкцию по изготовлению консервированных стандартных
эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях
(приложение 19).
2. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов
Российской Федерации обеспечить неукоснительное применение
утвержденных инструкций.
3. Управлению организации медицинской помощи населению,
Управлению охраны здоровья матери и ребенка обеспечить контроль за
своевременным внедрением в практику и качеством проведения
иммуносерологических исследований.
4. Считать недействующими на территории Российской Федерации:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при
переливании крови, утвержденную Минздравом СССР 05.12.90
N 05-14/37-14.
2. Инструкцию по изготовлению стандартных
изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови
системы АВО, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/26.
3. Инструкцию по определению групп крови системы АВО при
помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток, утвержденную
Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/27.
4. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/28.
5. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус
антител другой специфичности", утвержденную Минздравом СССР
27.11.90 N 10-11/136.
6. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови,
утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/29.
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на
плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и
реактива антирезус, предназначенных для этой цели, утвержденную
Минздравом СССР 06.12.90 N 05-14/38-14.
8. Инструкцию по применению цоликлона анти-D
диагностического жидкого для определения D антигена системы Резус
(антитела моноклональные анти-D), утвержденную Минздравом СССР
21.08.90.
9. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/30.
10. Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких
групп, предназначенных для определения различных изоантигенов
эритроцитов человека, утвержденную Минздравом СССР 26.03.79
N 06-14/3.
11. Методические рекомендации "Иммунизация доноров для
получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденную
Минздравом СССР 27.11.90 N 10-11/138.
12. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров
малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов,
утвержденную Минздравом СССР 14.10.76 N 06-14/1.
13. Методические рекомендации "Определение иммунных антител
групповой системы АВО", утвержденные Минздравом СССР 27.11.90
N 10-11/135.
5. Считать утратившими силу:
1. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и
анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови
человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В,
анти-АВ), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
2. Инструкцию по применению анти-Rhо(D) lgM моноклонального
реагента для определения резус-принадлежности крови человека
(цоликлона анти-D супер), утвержденную Минздравмедпромом России
14.07.94.
3. Инструкцию по применению цоликлона анти-rh'(С)
моноклонального для определения антигена С системы Резус на
эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер), утвержденную
Минздравмедпромом России 17.03.95.
4. Методические рекомендации "Способ выявления иммунных
анти-А, анти-В антител в сыворотке крови человека", утвержденную
Минздравом РСФСР 15.09.89.
6. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на
заместителя Министра Стародубова В.И.
Министр
здравоохранения
Российской Федерации
Т.Б.ДМИТРИЕВА
Приложение N 1
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРЕДУПРЕЖДЕНИЮ НЕСОВМЕСТИМОСТИ
ПРИ ПЕРЕЛИВАНИИ КРОВИ
I. ВВЕДЕНИЕ
1. Общие сведения.
Основным принципом предупреждения гемотрансфузионных
осложнений является обеспечение совместимости крови донора и
реципиента.
Прежде чем приступить к переливанию крови, врач должен
предусмотреть, чтобы кровь доноров была совместима с кровью
реципиента.
Под совместимостью понимается благоприятное сочетание крови
донора и реципиента. Биологически невозможное их сочетание по
антигенам и антителам различных групповых систем определяет
несовместимость крови донора и реципиента.
В настоящее время известно более 11 групповых систем крови
человека, но значение их в переливании крови неравноценно. В
первую очередь совместимость при переливании крови должна быть
обеспечена правильным выбором донора по группам крови системы АВО
и резус-антигену D.
2. Группы крови АВО.
Наибольшее значение для обеспечения совместимости при
переливании крови имеет выбор крови по системе АВО.
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания
антигенных свойств эритроцитов, называемых агглютиногенами, и
антител по отношению к ним - агглютининов, находящихся в плазме
крови людей.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В и два групповых
агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств
образуют четыре группы крови:
+----------------+----------------+--------------+--------------+
| |Агглютиногены | Антитела | Частота |
| Обозначение |в эритроцитах | в плазме |встречаемости |
| | | | в процентах |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|О альфа бета (I)| нет |анти-А(альфа) | 33,5 |
| | |анти-В(бета) | |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|А бета (II) | А |анти-В(бета) | 37,8 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
|В альфа (III) | В |анти-А(альфа) | 20,6 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
| АВо (IV) | А, В | нет | 8,1 |
+----------------+----------------+--------------+--------------+
Агглютинин А (альфа) является антителом по отношению к
агглютиногену А, а агглютинин В (бета) является антителом по
отношению к агглютиногену В. Ошибочное переливание иногруппной
крови, содержащей агглютиногены, против которых у больного имеются
антитела, т.е. крови, содержащей агглютиноген А, при наличии у
реципиента агглютининов альфа (анти-А) или крови, содержащей
агглютиноген В, при наличии у реципиента агглютинина бета
(анти-В), приводит к явлению несовместимости.
3. Система Резус (Rh-Hr).
Кроме антигенов системы АВО в эритроцитах людей имеется
множество других антигенов, образующих различные групповые
системы, независимые как от системы АВО, так и друг от друга.
Наиболее важное значение при переливании крови, после групп
крови АВО, имеют антигены системы резус D, C, E, с, е, Cw,
особенно обладающий наибольшей активностью антиген D, называемый
резус-фактором.
Эти антигены, находясь в эритроцитах людей в различных
сочетаниях, образуют 28 фенотипов (см. "Инструкцию по определению
резус-принадлежности крови").
Так же, как и антиген D, любой другой фактор этой системы
может вызвать образование изоиммунных антител у лиц, его не
имеющих, однако значительно реже и, большей частью, лишь как
сопутствующих антителам против антигена D.
Главным отличием системы резус от системы АВО является то, что
в крови людей содержатся только агглютиногены этой системы, а
антител по отношению к ним, подобных антителам альфа и бета
системы АВО, обычно, в норме у людей не имеется.
Однако у резус-отрицательных лиц при некоторых условиях (при
переливании или при другом способе введения резус-положительной
крови или во время беременности женщины резус-положительным
плодом) может произойти сенсибилизация, т.е. могут образоваться
изоиммунные антитела антирезус.
Последствием этой сенсибилизации у беременной женщины является
рождение детей с гемолитической болезнью или внутриутробная смерть
плода. Поэтому наличие у женщин такого анамнеза, так же как
сведения о трансфузионных реакциях как у женщин, так и у мужчин,
уже указывают на возможное наличие у них резус-антител.
Если больному, в крови которого имеются резус-антитела,
ошибочно перелить резус-положительную кровь, то это приведет к
явлению несовместимости.
Лиц, в крови которых содержится резус-антиген D, т.е.
резус-положительных (Rh+), около 85%.
15% людей являются резус-отрицательными (rh-). (Вычислено
среди лиц русской национальности).
4. Значение других групповых систем эритроцитов при
переливании крови.
Антигены других групповых систем также обладают активностью, в
первую очередь Келл (K), Даффи (Fy), Кидд (Jk), затем антигены
системы MNSs и другие.
Однако антигенная активность их значительно ниже и антитела по
отношению к ним встречаются редко.
Антитела ко всем этим антигенам могут образоваться у человека
любой группы системы АВО, а также, кроме антител анти-D,
независимо от резус-принадлежности, т.е. как у
резус-отрицательных, так и у резус-положительных лиц. Образуются
они при тех же условиях, что и антитела анти-D, т.е. при повторном
введении крови и беременностях, и могут служить причиной
заболевания новорожденного или трансфузионного осложнения.
5. Причины несовместимости и меры ее предупреждения.
Если реципиенту, в крови которого имеются антитела, перелить
кровь донора, эритроциты которого содержат антигены, против
которых направлены эти антитела, такая кровь будет разрушаться в
организме реципиента, т.е. она является для него несовместимой.
Перед переливанием крови врач должен убедиться в том, что
предназначенная для переливания кровь не содержит антигенов,
против которых в крови больного имеются антитела, т.е. совместима
с кровью реципиента.
Для того, чтобы не допустить переливания несовместимой крови и
следующих за этим клинических проявлений несовместимости, врач,
переливающий кровь, обязан:
- правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО;
- правильно выбрать кровь в отношении резус-принадлежности;
- проверить всю относящуюся к этому документацию;
- произвести контрольные исследования, включающие пробы на
совместимость.
Врач должен также учесть, что кроме нормально существующих
антител системы АВО - альфа и бета и имеющих большое практическое
значение изоиммунных антител антирезус-D у реципиента, хотя и
значительно реже, могут встретиться антитела к другим антигенам
эритроцитов: С, Е, с, е, Сw, K, Fy, Jk, M, N, S, s и др.
Предупреждению несовместимости по отношению к этим антигенам,
так же как и в отношении антигена D должно, в первую очередь,
служить тщательное выявление трансфузионного и акушерского
анамнеза. Кроме того, несовместимость к некоторым из них может
быть установлена при проведении проб на совместимость.
6. Выбор крови, совместимой в отношении групп крови АВО (см.
рис. 1).<*>
--------------------------------
<*> - Рисунки не приводятся.
Вопросы совместимости в отношении групп системы АВО решаются
различно в зависимости от того, переливается ли цельная кровь или
предполагается использовать эритроциты, освобожденные от плазмы
(отмытые, размороженные).
а) при переливании цельной крови она должна быть одноименной
по группам АВО, т.е. реципиенту может переливаться кровь той же
группы, к которой принадлежит он сам. При переливании цельной
крови детям это правило является обязательным.
При переливании крови взрослым реципиентам в исключительных
случаях допускается переливание крови группы 0 (I) реципиентам
другой группы, однако количество переливаемой крови в этих случаях
должно быть ограничено.
Эти ограничения связаны с тем, что групповые антитела у
доноров группы 0(I), особенно агглютинины альфа (анти-А), иногда
носят иммунный характер, бывают очень активными и поэтому могут
вызывать разрушение эритроцитов крови реципиента другой группы;
б) при использовании эритроцитов, освобожденных от плазмы
(отмытых, размороженных), эритроциты группы 0(I) являются как бы
универсальной трансфузионной средой и могут быть перелиты
реципиенту любой группы. Реципиенты группы АВ (IV), в крови
которых не содержится групповых антител, являются как бы
универсальными реципиентами и им могут быть перелиты эритроциты
любой группы крови, освобожденные от плазмы.
7. Выбор крови, совместимой в отношении резус-антигена D.
Кроме групп системы АВО, при переливании крови должна
учитываться резус-принадлежность донора и реципиента. Переливаемая
кровь должна быть одноименной с кровью реципиента в отношении
резус-принадлежности.
Это особенно важно для резус-отрицательных реципиентов,
независимо от наличия или отсутствия у них резус-антител, в
последнем случае для предупреждения возможного их образования.
При переливании эритроцитов, освобожденных от плазмы,
резус-положительным новорожденным с гемолитической болезнью,
рекомендуется введение резус-отрицательных эритроцитов.
8. Проверка документации.
Выбрав кровь для переливания больному, специалист обязан:
а) сравнить запись определения группы крови реципиента по
системе АВО (в истории болезни) и донора (на контейнере с кровью,
приготовленной для переливания) и убедиться, что, согласно этим
записям, кровь донора совместима с кровью реципиента в отношении
групп крови системы АВО;
б) проверить запись о резус-принадлежности в истории болезни
реципиента и на контейнере с кровью и убедиться, что кровь донора
и реципиента совпадают по резус-принадлежности.
После проверки документации необходимо сделать контрольные
исследования.
9. Контрольные исследования.
Независимо от проведенных исследований и имеющихся записей
непосредственно перед тем, как приступить к переливанию крови,
СПЕЦИАЛИСТ ОБЯЗАН:
а) определить групповую принадлежность крови больного и
сверить результат с записью в истории болезни и с обозначением
группы крови донора на контейнере (флаконе);
б) определить групповую принадлежность крови донора, взятой из
флакона (из трубочки контейнера), и сверить результат с записью на
нем;
в) произвести пробу на совместимость по группам крови АВО (см.
разделы I и III);
г) произвести пробу на совместимость по резус-антигену D (см.
разделы I, IV, V, VI).
II. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПРОБАХ НА СОВМЕСТИМОСТЬ
ПЕРЕЛИВАЕМОЙ КРОВИ
1. Порядок исследования.
Пробы на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D
проводятся отдельно и не могут заменить друг друга, так как
антитела разного характера требуют разных методов для своего
выявления.
Для проб на совместимость используется сыворотка крови
реципиента и консервированная кровь или эритроцитарная масса
донора.
Если больному переливается кровь из нескольких флаконов
(контейнеров), пробы на совместимость должны быть сделаны с кровью
из каждого флакона (контейнера), даже если на них обозначено, что
кровь получена от одного и того же донора.
Сыворотка больного должна быть свежей, полученной в тот же
день, когда делается переливание крови, или накануне при условии
сохранения ее при температуре 4-8ш С. Исключением являются сроки
взятия сыворотки для проведения пробы на совместимость у больных с
гемотрансфузионными осложнениями (см. раздел VII, п. 9).
2. Получение сыворотки больного и крови донора.
Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови без
стабилизатора в пробирку, на которой надписывают фамилию и
инициалы реципиента, группу его крови и дату. При этом врач должен
лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и
относятся к тому больному, у которого взята эта кровь.
Через 1-2 минуты пробирку с кровью сильно встряхивают для
отделения свертка от стенок пробирки или обводят его сухой
стеклянной палочкой.
После ретракции свертка от него отделяется сыворотка, которая
и служит для пробы на совместимость.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: если необходимо ускорить отделение
сыворотки, пробирку с кровью центрифугируют около 5 мин. при
2000-3000 об/мин.
Кровь донора получают из контейнера, который подготовлен
для переливания. Для этого кровь выпускают через иглу в небольшом
количестве (5-10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой
будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывают
фамилию, инициалы донора, группу его крови и номер контейнера. При
этом врач должен лично убедиться в том, что на пробирке
(пластинке) правильно написаны все сведения о доноре, имеющиеся на
контейнере, из которого получена эта кровь.
3. Характеристика антител системы АВО и условия проведения
пробы на совместимость по группам крови АВО.
Антитела системы АВО - альфа и бета - являются врожденными у
человека. Они представляют собой агглютинины, вызывающие
склеивание несовместимых эритроцитов в прямой реакции между
сывороткой и эритроцитами. Эта реакция хорошо протекает на
плоскости при температуре около 20ш и поэтому при этих же условиях
производится проба на совместимость по группам крови АВО.
4. Характеристика резус-антител.
В отличие от нормальных естественных антител системы АВО
антитела антирезус, так же как и другие аллоиммунные антитела, не
являются врожденными, а появляются в крови у человека лишь
вследствие изоиммунизации и отличаются от антител системы АВО, в
частности, тем, что требуют других условий для своего выявления.
Антиэритроцитарные антитела бывают разной формы: полные и
неполные. Полные антитела активны при проведении реакции в солевой
среде при температуре 37ш; неполные проявляют свое действие в
других условиях, которыми являются: проведение реакции в нативной
сыворотке с подогревом, добавлением различных коллоидов или других
реактивов.
5. Способы выявления резус-антител и выбор методики для
проведения пробы на совместимость по резус-антигену D.
Ввиду того, что при сенсибилизации к резус-антигену D в
подавляющем большинстве случаев образуются неполные антитела, а
полные антитела образуются редко и почти всегда вместе с
неполными, в лечебной практике обычно используются для пробы на
совместимость те реакции, которые выявляют именно неполные
антитела. Такими пробами являются:
а) проба с применением полиглюкина (раздел IV);
б) проба с применением желатина (раздел V);
в) непрямая проба Кумбса (раздел VI);
г) проба на плоскости при температуре 48ш С (раздел VII).
Все перечисленные пробы выявляют неполные резус-антитела и
поэтому в лечебной практике для определения совместимости можно
пользоваться любой из них, однако наиболее чувствительными
являются непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина.
Кроме резус-антител эти пробы выявляют и многие неполные
изоиммунные антитела другой специфичности. Поэтому непрямая проба
Кумбса и проба с применением желатина особенно рекомендуются как
проба на совместимость при переливании крови больным, перенесшим
трансфузионную реакцию, и другим сенсибилизированным лицам,
чувствительным к введению чужих эритроцитов, хотя и совместимых по
группе крови системы АВО и по резус-принадлежности<*>.
--------------------------------
<*> - Примечание: при проведении проб на совместимость по
резус-антигену D следует учитывать, что если резус-отрицательному
больному будет ошибочно выбрана резус-положительная кровь, это
может быть выявлено только в том случае, если у реципиента имеются
в крови резус-антитела. Выявить различие в резус-принадлежности
крови донора и реципиента, если последний не имеет антител, пробы
на совместимость не могут.
Предупреждение таких ошибок должно быть обеспечено
предварительным определением резус-принадлежности крови донора и
реципиента и тщательной проверкой записей результатов в истории
болезни и на контейнере с кровью.
III. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ
ПО ГРУППАМ КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
Проба на совместимость по группам крови АВО производится в
течение 5 минут, на плоскости, при комнатной температуре.
Техника.
Для исследования следует использовать белую фарфоровую или
любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью. На
пластинке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного,
фамилию, инициалы и группу крови донора и номер контейнера с
кровью.
На пластинку накапать 2-3 капли сыворотки больного и туда же
добавить маленькую каплю крови донора так, чтобы соотношение крови
и сыворотки было приблизительно 1:10 (для удобства рекомендуется
сначала спустить через иглу несколько капель крови донора на борт
пластинки, а затем оттуда концом сухой стеклянной палочки
перенести маленькую каплю крови для перемешивания с сывороткой
больного).
Кровь размешать с сывороткой сухой стеклянной палочкой,
пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в покое и
снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом
реакции в течение 5 минут.
Оценка результата.
Если в смеси сыворотки больного и крови донора наступила
агглютинация эритроцитов - агглютинаты видны сначала в виде
мелких, затем крупных комочков на фоне полностью или почти
полностью обесцвеченной сыворотки - это значит, что кровь донора
несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если смесь крови донора и сыворотки больного по истечении 5
минут остается гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации,
то это означает, что кровь донора совместима с кровью больного в
отношении групп крови системы АВО.
Следует помнить, что при несовместимости по группам крови АВО
агглютинация наступает обычно в течение первой минуты, но при
низком титре антител у больного, а также при слабо выраженной
активности агглютиногена у донора (например, подгруппа А2),
агглютинация может наступить значительно позже, иногда только к
концу 5-й минуты.
При некоторых патологических состояниях, например, при ожогах,
циррозах печени, при септико-пиемических состояниях, сыворотка
больных приобретает свойство вызывать неспецифическое склеивание
эритроцитов в так называемые монетные столбики, симулирующие
агглютинацию, поэтому выбор совместимой крови таким больным бывает
затруднен.
В этих случаях следует вновь проверить групповую
принадлежность крови донора и больного и, если в этом отношении не
было ошибки и кровь выбрана правильно, проверить результат пробы
на совместимость микроскопически при подогревании и добавлении
изотонического раствора NaCl. Для этого снова произвести пробу и,
если при микроскопии видны не агглютинаты из эритроцитов, а
"монетные столбики", и при последующем добавлении 2-3 капель
изотонического раствора NaCl и подогревании до 37 ш С они
расходятся и эритроциты располагаются в виде гомогенной взвеси -
можно считать кровь донора совместимой в отношении групп крови
системы АВО.
После того, как установлена совместимость по группам крови
системы АВО, врач должен убедиться, что кровь донора совместима с
кровью больного также в отношении резус-антигена D, для чего
произвести еще одну из проб на совместимость: пробу с 33%-ным
раствором полиглюкина (раздел IV), пробу с применением желатина
(раздел V) или непрямую пробу Кумбса (раздел VI), пробу на
плоскости при температуре +48ш С (раздел VII).
IV. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ
С ПРИМЕНЕНИЕМ 33% РАСТВОРА ПОЛИГЛЮКИНА
Проба проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут.
Для пробы применяется 33%-ный раствор полиглюкина, приготовленный
специально для лабораторных целей.
Техника.
Для исследования использовать центрифужную или любую другую
пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы, группу крови
больного и донора, номер контейнера с кровью.
На дно пробирки пастеровской пипеткой внести 2 капли сыворотки
больного, одну каплю донорской крови, одну каплю 33% раствора
полиглюкина и перемешать содержимое путем встряхивания.
Пробирку наклонить почти до горизонтального положения, затем
медленно поворачивать таким образом, чтобы содержимое ее
растекалось по стенкам. Такое растекание содержимого пробирки по
стенкам делает реакцию более выраженной.
Контакт эритроцитов с сывороткой больного при поворачивании
пробирки следует продолжать не менее 3 минут. Через 3-5 мин. в
пробирку долить 2-3 мл изотонического раствора NaCl и перемешать
содержимое путем 2-3-х кратного перевертывания пробирки. (Не
взбалтывать!)
Оценка результата.
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов в виде
взвеси мелких или крупных комочков иногда хлопьевидной формы на
фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости, это
значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не
должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в
нем не наблюдается признаков агглютинации эритроцитов, это значит,
что кровь донора совместима с кровью больного в отношении
резус-антигена D.
V. ПРОБА НА СОВМЕСТИМОСТЬ С ПРИМЕНЕНИЕМ
10% РАСТВОРА ЖЕЛАТИНА
Проба производится в пробирке при температуре 46-48ш С в
течение 10-15 минут.
Техника.
Для исследования использовать центрифужную или любую другую
пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови
больного и донора, и номер контейнера с кровью.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: для удобства рекомендуется сначала выпустить
из флакона через иглу несколько капель крови донора в другую
пробирку, а затем оттуда пастеровской пипеткой перенести маленькую
каплю в пробирку.
На дно пробирки при помощи пипетки поместить одну маленькую
каплю эритроцитов донора, затем туда накапать две капли
подогретого до разжижения 10% раствора желатина и 1-2 капли
сыворотки больного. Раствор желатина необходимо тщательно
просмотреть перед употреблением. При помутнении или появлении
хлопьев желатин непригоден.
Содержимое пробирки перемешать путем встряхивания и поместить
ее в водяную баню или в горизонтальном положении в термостат при
46-48ш С на 15 мин.
После инкубации долить в нее 5-8 мл изотонического раствора
NaCl, содержимое пробирки перемешать 1-2-кратным перевертыванием
ее и просмотреть на свет невооруженным глазом и затем путем
микроскопирования.
Оценка результата.
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов -
эритроциты видны в виде взвеси мелких, реже крупных комочков на
фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости -
это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не
должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в
нем не наблюдается каких-либо признаков агглютинации, это значит,
что кровь донора совместима с кровью реципиента (см. рис. 3).<*>
--------------------------------
<*> - Рисунок не приводится.
VI. НЕПРЯМАЯ ПРОБА КУМБСА, КАК ПРОБА НА
СОВМЕСТИМОСТЬ ПЕРЕЛИВАЕМОЙ КРОВИ
Непрямая проба Кумбса, как проба на совместимость переливаемой
крови, производится путем инкубации сыворотки больного с
эритроцитами донора в течение 45 минут при 37шС с последующим
отмыванием их, добавлением специального реактива (сыворотки для
пробы Кумбса) и наблюдением в течение 20 мин.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: в этой пробе агглютинация
сенсибилизированных эритроцитов происходит за счет иммунных
антител против белка крови человека, находящихся в сыворотке для
пробы Кумбса. Последняя приготавливается из крови животных,
предварительно иммунизированных сывороткой крови человека.
Техника.
Пробирку с кровью донора долить до верха изотоническим
раствором NaCl и перемешать содержимое путем перевертывания
пробирки. Пробирку центрифугировать около 5 мин. до оседания
эритроцитов, после чего отсосать надстой жидкости и снова
повторить процедуру отмывания эритроцитов.
На другой центрифужной или любой небольшой пробирке надписать
фамилию, инициалы и группу крови больного и донора и номер флакона
с кровью. На дно этой пробирки при помощи пастеровской пипетки
перенести из первой пробирки одну маленькую каплю (0,05 мл)
отмытых эритроцитов донора и добавить к ним 3 капли сыворотки
больного.
Сыворотку перемешать с эритроцитами встряхиванием пробирки,
после чего поставить ее в термостат при 37ш С на 45 минут.
Через 45 минут пробирку вынуть из термостата, долить в нее до
верха изотонический раствор NaCl, перемешать содержимое и
центрифугировать до осаждения эритроцитов. Такое отмывание
произвести 2 раза, а если используется видалевская или еще меньшая
пробирка - 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая отмывную
жидкость.
К отмытым, плотно осевшим, эритроцитам добавить 4-6 капель
изотонического раствора NaCl для получения приблизительно 5%
взвеси эритроцитов.
Одну каплю 5% взвеси эритроцитов перенести на белую фарфоровую
или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью,
добавить туда 1-2 капли сыворотки для пробы Кумбса и перемешать
капли стеклянной палочкой.
Пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в
покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за
ходом реакции в течение 20 минут.<*>
--------------------------------
<*> - Примечание: при несовместимости в непрямой пробе Кумбса
агглютинация обычно наступает в течение первой минуты. Однако
следует помнить, что при низком титре резус-антител (или других
антител) агглютинация может наступить значительно позже, иногда к
концу 20-й минуты.
Оценка результата.
Если добавление сыворотки для пробы Кумбса вызовет
агглютинацию эритроцитов - агглютинаты видны в виде комочков на
просветленном или полностью обесцвеченном фоне - это значит, что
кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему
перелита.
Если взвесь эритроцитов осталась гомогенно окрашенной, без
признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с
кровью больного в отношении резус-антигена D, а также в отношении
других изоантигенов, к которым могли образоваться изоиммунные
антитела неполной формы.
В районах, где до настоящего времени использовалась только
проба на совместимость на чашке Петри, временно допускается
сохранение этой пробы в период перехода на пробы с применением 10%
раствора желатина или 33% раствора полиглюкина или использования
непрямой пробы Кумбса.
VII. МЕРЫ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ НЕСОВМЕСТИМОСТИ ПО ОТНОШЕНИЮ
К ДРУГИМ АНТИГЕНАМ СИСТЕМЫ РЕЗУС И АНТИГЕНАМ ДРУГИХ
СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ. ПОДБОР КРОВИ ДЛЯ
ИЗОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ БОЛЬНЫХ
1. Общие сведения.
Выше было сказано, что, кроме антигенов системы АВО и
резус-антигена D, причиной несовместимости при переливании крови
могут быть другие антигены системы резус или антигены других
систем. Это может произойти в тех случаях, когда кровь
переливается сенсибилизированному больному, имеющему в крови
антитела против этих антигенов.
Для решения вопроса о возможной сенсибилизации больного к
различным антигенам первостепенное значение имеет трансфузионный и
акушерский анамнез. Наличие в анамнезе указаний на возможную
сенсибилизацию (см. п. 4) требует дальнейшего исследования крови
реципиента (см. п. 5) и, если будут найдены антитела, специального
выбора или индивидуального подбора крови (см. п.п. 6, 7). Следует
отметить, что многие изоиммунные антитела выявляются теми же
методами, что и антитела анти-D, некоторые - так же как антитела
системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора в отношении этих
антител может быть выявлена уже при выполнении проб на
совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D.
2. Значение пробы на совместимость по группам крови АВО для
выявления других антител.
В некоторых случаях в крови у людей образуются изоиммунные
антитела анти-М и анти-N. Эти антитела в большинстве случаев
активны в тех же условиях, что и антитела системы АВО, т.е.
вызывают агглютинацию эритроцитов на плоскости при комнатной
температуре. Поэтому, если у больного имеются антитела анти-М или
анти-N, а эритроциты донора содержат эти факторы, то
несовместимость по отношению к ним выявится при пробе на
совместимость по группам крови АВО. Кровь такого донора не должна
быть перелита этому реципиенту.
В таких случаях кровь реципиента необходимо исследовать в
лаборатории на изоиммунные антитела. Предварительно следует
проверить правильность определения группы крови и
резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет
отложить трансфузию до получения результатов исследования
специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь
путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами
крови донора.
3. Значение проб на совместимость по резус-антигену для
выявления других антител.
При проведении проб на совместимость по резус-антигену D можно
выявить также неполные изоиммунные антитела к другим антигенам
системы резус: С, Е, с, е, а иногда и к антигенам других систем
эритроцитов. С этой точки зрения наиболее чувствительными являются
непрямая проба Кумбса и проба с желатином, при помощи которых
выявляются неполные антитела ко всем антигенам системы Резус,
системам Келл-Челлано, Даффи, Кидд и некоторым другим.
Следовательно, если в крови реципиента имеются такие антитела, то
проба Кумбса и проба с желатином выявят несовместимость крови
донора, в которой содержатся эти антигены. Кровь такого донора не
должна быть перелита этому реципиенту.
Для уточнения специфичности антител и выбора совместимого
донора кровь реципиента необходимо исследовать в
специализированных лабораториях. Предварительно следует проверить
правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если
состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения
результатов исследования специфичности антител, следует попытаться
найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с
несколькими образцами крови доноров.
4. Учет трансфузионного и акушерского анамнеза.
Если больной получал трансфузии крови, одноименной или
совместимой по группам крови системы АВО и резус-принадлежности D,
но несмотря на это, трансфузии сопровождались реакциями или
осложнениями, это указывает на возможную сенсибилизацию больного к
другим антигенам системы резус или к антигенам других систем и на
несовместимость для него крови, содержащей эти антигены.
Если женщина имела беременности, закончившиеся рождением детей
с гемолитической болезнью или рождением мертвых плодов, и кровь
этой женщины резус-положительная или резус-отрицательная, но не
содержит антител анти-D, то это также указывает на возможную
сенсибилизацию женщины к какому-либо другому антигену системы
резус или других систем и на несовместимость для нее крови,
содержащей эти антигены.
В таких случаях кровь реципиента должна быть заблаговременно
исследована на наличие изоиммунных антител.
5. Исследование крови на наличие изоиммунных антител.
Определение изоиммунных антител производится специалистами-
серологами в учреждениях службы крови (отделениях, станциях
переливания крови), располагающих стандартными эритроцитами
различной фенотипической структуры. Для этой цели удобно
пользоваться эритроцитами группы 0(I). Среди них должны быть
образцы эритроцитов резус-отрицательные и резус-положительные
различного фенотипа: CcDEe, CcDee, CCDеe, ccDEе, ссDЕЕ, ccDee,
Сcddеe, ccddЕе.
Среди резус-положительных эритроцитов целесообразно иметь
образцы гомозиготные и гетерозиготные по антигенам С и Е, т.е.,
содержащие и не содержащие антигены с и е.
Среди резус-отрицательных эритроцитов следует иметь образцы
различные по антигенам системы Даффи, Келл-Челлано, Кидд. Кроме
того, все стандарты должны быть типированы по системе MNSs, Pp,
Левис и др.
Ввиду того, что изоиммунные антитела могут быть как полной,
так и неполной формы, их следует выявлять, используя разные методы
при различных температурных режимах. Для выявления неполных
антител необходимо проводить непрямую пробу Кумбса или реакции с
использованием коллоидов (желатин, полиглюкин). Для выявления
полных антител проводят реакцию солевой агглютинации при разных
температурах: 37ш, 20ш, 4ш С.
Заключение о наличии, а также о форме и специфичности антител
делают по результатам реакции во всех методах.
Форма антител. Если положительная реакция выявилась с
различными образцами эритроцитов только при проведении непрямой
пробы Кумбса (или реакции с применением желатина или полиглюкина),
это значит, что в исследованной сыворотке содержатся только
неполные антитела.
Если положительная реакция выявилась при непрямой пробе Кумбса
(или в реакции с применением желатина или полиглюкина) и
одновременно в реакции солевой агглютинации, это значит, что в
сыворотке содержатся как неполные, так и полные антитела. Полные
антитела могут быть тепловыми, тогда положительный результат
выявится при температуре 37ш С, или холодовыми, давшими
положительный результат при 20ш С или 4ш С.
Если сыворотка дала положительный результат только в реакции
солевой агглютинации в пробирках, это значит, что она содержит
только полные антитела - тепловые или холодовые (в зависимости от
того, при какой температуре выявилась агглютинация).
Если агглютинация эритроцитов не наблюдается ни в одной из
этих проб, это говорит об отсутствии как полных, так и неполных
изоиммунных антител к антигенам, содержащимся в стандартных
эритроцитах, которые были использованы при этом исследовании.
Специфичность антител устанавливается в зависимости от
результатов реакции со стандартными эритроцитами, содержащими
разные антигены. Это заключение необходимо сделать для полных и
неполных антител в отдельности.
Большую роль при определении специфичности антител может
сыграть определение антигенной структуры эритроцитов самого
больного. Если такое исследование было возможным, то это очень
облегчит решение вопроса о специфичности антител, так как у
больного могут быть антитела только к тем антигенам, которые не
содержатся в его собственной крови.
Неполные антитела в одной и той же сыворотке могут иметь как
одну, так и различную специфичность.
При одновременном присутствии в сыворотке неполных и полных
антител они также могут быть одной или различной
специфичности.
Полные антитела большей частью бывают моноспецифичными.
Таким образом, исследование сыворотки больного с применением
разных методов при наличии стандартных эритроцитов, типированных
по различным изоантигенам, позволяет решить вопрос о характере
иммунизации.
Если у больного выявлены изоиммунные антитела, то, зная их
специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании
крови специальным выбором донора (см. п. 6).
Если у больного выявлены антитела, но определить их
специфичность невозможно, например, из-за недостаточного набора
стандартных эритроцитов, совместимость переливаемой крови можно
обеспечить индивидуальным подбором донора (см. п. 7).
6. Специальный выбор донора.
Специальный выбор донора (донорской крови) производится на СПК
или ОПК в тех случаях, когда установлена форма и специфичность
имеющихся у больного антител, а на СПК или ОПК имеются доноры,
типированные по этим антигенам. Выбор производится из числа лиц
одногруппных по системе АВО и резус-принадлежности.
Если предполагается переливать эритроциты, освобожденные от
плазмы, можно использовать также и разногруппную кровь, но
совместимую в отношении эритроцитов донора.
В этих случаях эритроциты группы 0(I) можно переливать
реципиентам любой группы, а реципиентам группы АВ (IV) -
эритроциты любой группы крови, но в обоих случаях одноименные по
резус-принадлежности.
Далее выбираются доноры, не содержащие в крови антигенов,
против которых у больного обнаружены антитела. После такого
специального выбора донора, эритроциты которого не содержат
антигенов, против которых у больного выявлены изоиммунные
антитела, кровь этого донора следует проверить в пробах на
совместимость с сывороткой больного с обязательным включением того
метода, в котором оказались активными антитела больного. Затем,
при благоприятном результате этих исследований, от донора
заготавливается кровь (или берется кровь, заготовленная от него
ранее) и передается в лечебное учреждение специально для этого
больного.
Несмотря на специальный выбор крови, врач должен перед
трансфузией провести все контрольные исследования, предусмотренные
в разделе 1, 9 и только после этого он может приступить к
переливанию крови, начав его с биологической пробы.
В тех случаях, когда СПК или ОПК не располагают кровью
доноров, типированных как необходимо для конкретного больного,
подбор крови такому сенсибилизированному больному следует
проводить индивидуально.
7. Индивидуальный подбор донора.
Индивидуальный подбор донора (донорской крови) производится по
следующим показаниям:
а) в тех случаях, когда трансфузиолог обнаружил
несовместимость в пробах по группам крови АВО или резус-антигену и
контрольная проверка исключает ошибки в отношении этих антигенов
и если при этом состояние больного позволяет отложить трансфузию,
чтобы дополнительно исследовать кровь на изоиммунные антитела.
Подбор осуществляют, используя ту же реакцию, с помощью
которой обнаружены антитела. Если агглютинация наблюдалась при
проведении пробы на совместимость по группам крови АВО, то подбор
крови следует вести на плоскости при комнатной температуре. Если
агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по
резус-антигену D, то подбор следует проводить, используя непрямую
пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (разделы IV,
V).
Когда будет подобрана кровь, не дающая агглютинации с
сывороткой больного, следует провести с ней все другие реакции,
предусмотренные при переливании. В тех случаях, когда для
переливания подбиралась кровь из флакончиков-спутников, врач
должен повторить все исследования, взяв кровь непосредственно из
контейнера, подготовленного для трансфузии. При отсутствии
признаков несовместимости врач может приступить к переливанию
крови, начав его с биологической пробы.
Следует учесть, что если несовместимость выявлена только по
группам крови АВО, а контрольные пробы исключают ошибку по этим
антигенам, то это чаще всего бывает за счет антител анти-М или
анти-N и подобрать совместимую кровь в этих случаях удается обычно
уже среди 5-6 образцов. Если несовместимость выявилась из-за
наличия неполных антител, подбор может оказаться более трудным,
но все же, если трансфузия срочная, можно попытаться найти
совместимую кровь.
б) индивидуальный подбор проводится также в тех случаях, когда
определены наличие и специфичность изоиммунных антител в крови
больного, но СПК и ОПК не имеет возможности специально выбрать
кровь из-за отсутствия типированного донора с подходящей для
данного больного антигенной структурой. Подбор в этих случаях
проводится с кровью, взятой из флакончиков-спутников, или с
кровью, полученной непосредственно у доноров из пальца. Начинать
подбор следует, используя ту реакцию, в которой оказались
активными изоиммунные антитела. Если выявлены полные антитела, то
следует учитывать и температуру, при которой они оказались
активными.
Вероятность нахождения совместимой крови в таких случаях
зависит от специфичности антител. При антителах с или е подбор
следует вести из числа резус-положительных доноров. При этом
обычно удается довольно быстро найти с-отрицательную кровь (16%),
но значительно труднее е-отрицательную ввиду редкой встречаемости
лиц, не содержащих этого фактора (2,5%).
Большая или меньшая трудность подбора крови при антителах
другой специфичности будет зависеть также от частоты факторов, к
которым направлены антитела. Особенно затруднен подбор бывает при
наличии антител к фактору Челлано, выявленному у 99,85% лиц, а
также в случае сочетания антител разной специфичности.
После такого индивидуального подбора кровь, заготовленная от
доноров, передается в лечебное учреждение для переливания данному
больному.
в) индивидуальный подбор крови донора следует проводить также
в тех случаях, когда у больного выявлены изоиммунные антитела, но
не установлена их специфичность. Это может быть связано с
ограниченностью на СПК (ОПК) образцов стандартных эритроцитов,
типированных по изосерологическим системам, а также, возможно, с
наличием в крови больного антител к неизвестному до этого времени
антигену. Подбор в таких случаях следует проводить, используя
кровь из флакончиков-спутников или кровь, полученную
непосредственно у донора из пальца, начиная его той же реакцией, с
помощью которой оказались активными антитела больного. В таких
случаях решить заранее вопрос, среди каких доноров легче подобрать
кровь, бывает трудно. После такого индивидуального подбора кровь
передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
8. Использование подобранной крови.
Как специальный, так и индивидуальный подбор крови,
производимой на СПК (ОПК), является предварительной процедурой.
Врач-трансфузиолог, получив флакон с кровью, должен во избежание
ошибки сверить паспортные данные на флаконе с данными о крови
больного в истории болезни, произвести контрольные реакции -
определение группы крови больного и донора и пробы на
совместимость. При совпадении группы крови и резус-принадлежности
больного и донора и отсутствии агглютинации в пробах на
совместимость, врач может приступить к переливанию крови, начав
его с биологической пробы.
9. Особенности пробы на совместимость у больных с
гемотрансфузионными осложнениями.
У больных, перенесших гемотрансфузионное осложнение,
происходят характерные серологических сдвиги, заключающиеся в том,
что в период до 10-20-го дня идет нарастание сенсибилизации,
выражающееся в повышении титра антител, послуживших причиной
осложнения, и в появлении антител другой специфичности. После
20-го дня начинается постепенное снижение титра антител и
исчезновение их в порядке, обратном появлению. Поэтому таким
больным в период нарастания сенсибилизации пробу на совместимость
следует проводить с сывороткой, полученной от них непосредственно
в день проведения трансфузии крови или не далее чем накануне. При
переливании крови после 20-го дня, кроме этой пробы, желательно
дополнительно проводить пробу на совместимость с порцией
сыворотки, заготовленной на высоте сенсибилизации (10-20-й день).
Это дает возможность предупредить переливание больному крови,
содержащей антиген, против которого у него совсем недавно имелись
антитела.
VIII. ЗАПИСИ О ВЫБОРЕ КРОВИ И
ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Врач, переливающий кровь, обязан записать в истории болезни:
1) паспортные данные с каждого контейнера с кровью - фамилию и
инициалы донора, группу крови, резус-принадлежность, номер
контейнера и дату заготовки крови;
2) результат контрольной проверки групповой принадлежности
крови больного;
3) результат контрольной проверки групповой принадлежности
крови донора, взятой из контейнера;
4) результат пробы на совместимость по группам крови АВО;
5) метод и результат пробы на совместимость по резус-антигену
D.
Записи скрепляются подписью врача.
IX. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Самыми важными показателями, позволяющими судить о
совместимости переливаемой крови (эритроцитов) являются
совместимость по группе крови системы АВО и совместимость по
резус-антигену D.
Для обеспечения совместимости переливаемой крови необходимо на
основании определения группы крови реципиента и записи в истории
болезни, а также документации на контейнере с кровью, правильно
выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО и
резус-принадлежности (см.раздел I, п.п. 6,7).
Непосредственно перед переливанием крови, независимо от
проведенных ранее исследований и имеющихся записей, врач обязан
снова проверить групповую принадлежность реципиента и крови донора
(раздел I. 9), сделать пробу на совместимость по группам крови АВО
(раздел III) и одну из проб на совместимость по резус-антигену D
(разделы IV, V, VI, VII).
Врач должен предусмотреть возможную несовместимость
по отношению к другим антигенам и принять меры для ее
предупреждения.
Если кровь (эритроциты) донора оказалась несовместимой с
кровью реципиента в пробе на совместимость по группам АВО или в
пробе на совместимость по резус-антигену D, она не должна быть ему
перелита!
Если кровь (эритроциты) донора оказалась совместимой с кровью
реципиента в пробах на совместимость по группам крови АВО и
резус-антигену D и нет указаний на несовместимость по отношению к
другим антигенам - кровь (эритроциты) может быть перелита.
Переливание начинается с биологической пробы.
Ответственным за выполнение перечисленных требований и
обеспечение совместимости при переливании крови является
врач-специалист, переливающий кровь.
"Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании
крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 05 декабря
1990 года N 05-14/37-14, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 2
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ
СЫВОРОТОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются
сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других
жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки
предназначаются для определения групповой принадлежности крови
людей по системе АВО.
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой
прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой
принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке
указывают названия учреждения, изготовившего сыворотку,
специфичность, титр агглютининов и срок годности.
I. ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК
Источниками получения стандартных сывороток служат:
а) кровь, заготовленная без консерванта от донора,
предварительно обследованного и содержащего в крови групповые
антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных
сывороток;
б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или
отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам не
использованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела
с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
в) дополнительный источник - плевральный транссудат,
асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с
титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток.
II. УСЛОВИЯ ПРИГОДНОСТИ СТАНДАРТНОЙ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются
следующие требования:
а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать
определенные групповые антитела - альфа (анти-А), бета (анти-В)
или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической
агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы 0(I).
Сыворотка группы АВ (IV), не содержащая групповых агглютининов, не
должна вызывать агглютинации;
б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых
признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В
в течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы
А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к
эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже,
чем 1:16;
в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия;
г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция,
что не влияет на качество сыворотки;
д) должна быть окрашена: группа А (II) в светло-синий цвет,
группа В (III) - в красный цвет, группа АВ (IV) - в желтый цвет.
е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением
консервирующих средств;
ж) должна иметь точную паспортизацию, т. е. обозначение
групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и
наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны
быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со
стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации
изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также
сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных
проверок ее качества.
III. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАБОТЫ ПО ПРИГОТОВЛЕНИЮ
СТАНДАРТНОЙ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
1. Предварительное определение пригодности крови донора для
изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки
путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем
получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования
производятся заранее в пробной порции крови, полученной
непосредственно от донора в небольшом количестве.
2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или
получение плазмы от донора при помощи плазмафереза.
3. Предварительное определение пригодности плазмы,
предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для
изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки.
5. Сбор остатков крови из флакончиков(пробирок)- спутников в
общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и
предварительное определение пригодности для изготовления
стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости,
плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и
предварительное определение пригодности этого материала для
изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления
из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее:
а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых
агглютининов);
б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию;
в) определение гемолизирующих свойств сыворотки;
г) определение активности сыворотки;
д) скорость наступления агглютинации;
е) титр агглютининов.
8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки.
9. Консервирование сыворотки.
10. Первый контроль сыворотки до розлива.
11. Второй контроль сыворотки до розлива.
12. Фильтрование сыворотки.
13. Окрашивание сыворотки.
14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки.
15. Розлив сыворотки.
16. Паспортизация разлитой сыворотки.
17. Контроль разлитой сыворотки.
IV. МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи
стандартных эритроцитов.
Определение производится на белой фарфоровой или любой другой
белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой
надписываются обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В".
Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной
маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп 0(I),
А(II), и В (III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую
каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение
количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10.
Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой,
пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в
покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат.
Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую
каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1
мл) изотонического раствора NaCl и снова покачивают пластинку.
Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в
каждой капле. При этом возможны четыре варианта:
- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В (III),
но отсутствует с эритроцитами группы 0(I). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и
бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к
группе О альфа бета(I);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы В(III) и
отсутствует с эритроцитами групп О(I) и А(II). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В),
т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе А бета(II);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и
отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на
наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А),
т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе В альфа(III);
- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это
указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на
принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ (IV).
2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию.
Эти исследования можно проводить одновременно с определением
групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.
Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов
группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.
Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и
группы О(I) проводят до 20 минут.
Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов
одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает
свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях
учитывают скорость ее наступления и интенсивность.
3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.
Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с
определением групповой принадлежности при помощи стандартных
эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает
их гемолиз, значит сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.
4. Определение скорости наступления агглютинации.
Скорость наступления агглютинации определяют так же, как
групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но
с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов
группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью
секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до
момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по
отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.
5. Определение титра агглютининов.
Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке
приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NaCl. Для
этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят
градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствор NaCl. Затем
в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой
сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем
встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во
вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В
результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до
1:1024.
Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения
сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в
пробирке первое исходное разведение (любое).
Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель
изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом
разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6
пронумерованных точек на пластику: в первую точку 2 капли, во
вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить
изотонический раствор: во вторую точку 1 каплю, в третью - 2
капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5
капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с
последней точки в направлении к первой. Так получают разведения
сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.
При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к
эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное
разведение сыворотки 1:24.
Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и
изотонический раствор NaCl каплями, для чего используют одну и ту
же пипетку.
На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1
мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на
пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени
разведения сыворотки 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024.
Разведения сыворотки можно приготавливать также
непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных
точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл)
испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой
переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой,
получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки
наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов
соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют
агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины
бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.
Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с
сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку
покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова
покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.
Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила
агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут,
принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.
V. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ПРИГОДНОСТИ КРОВИ
ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИЗ НЕЕ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ
Основным показателем пригодности крови донора для изготовления
из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость
наступления агглютинации и титр агглютининов.
Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30
секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с
эритроцитами группы А2.
Титр сыворотки должен быть: для агглютинина альфа не ниже, чем
1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже, чем 1:16 по отношению
к эритроцитам А2 и для агглютинина бета не ниже, чем 1:32 к
эритроцитам В.
При предварительном исследовании непосредственно взятой
пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на
одно разведение выше, ввиду возможного его падения в процессе
обработки и консервирования основной порции крови.
Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови
неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов.
Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию
эритроцитов, позднее, чем через 2 минуты, то это не является
противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства
при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают.
Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2
минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной
сыворотки не следует.
Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно на наблюдается,
но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует.
В этом случае так же, как и при выраженной неспецифической
реакции, донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому
обследованию.
Доноров, кровь которых соответствует требованиям,
предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый
учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления
стандартных сывороток.
VI. ВЗЯТИЕ КРОВИ У ДОНОРА И ОТДЕЛЕНИЕ ОТ НЕЕ СЫВОРОТКИ
Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через
15-30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от
стенки и затем помещают на сутки в холодильник при 4-8ш С.
Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в
другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при
4-8ш С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется еще
некоторое количество сыворотки, которую присоединяют в первой
порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на
100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл
сыворотки.
Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала
на один час в термостат, а затем в холодильник.
Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой
надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя и отчество
донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество
крови и полученной из нее сыворотки, а также результат
исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в
"Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления
стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка см. пункт IX).
Получение сыворотки из крови, оставшейся во флакончиках
(пробирках) - спутниках после взятия ее у доноров.
Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из
флакончиков (пробирок) - спутников. Для этого остатки крови
сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе
надписывают группу крови и дату заготовки.
VII. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ ИЗ ПЛАЗМЫ
При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется
фибрин. Это можно осуществить несколькими способами.
1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл
20% или 6 мл 10% на 100 мл плазмы. Через 30-40 минут во флаконе
образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон
следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым
оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся
сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон.
Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные.
Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова
выпадает сверток фибрина; в этих случаях сыворотку еще раз
переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон.
2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с
титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают,
оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают
в холодильник на 10-14 дней. На паспорте флакона дописывают
сведения о дате и количестве добавленной сыворотки.
За 10-14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме
того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или
неспецифическую агглютинацию эритроцитов.
Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с
тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные
данные.
Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона
на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о
дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал
регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной
сыворотки системы АВО".
Дальнейшая обработка сыворотки (см. пункт IX).
VIII. ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ ИЗ ПЛЕВРАЛЬНОГО ТРАНССУДАТА
И АСЦИТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ
В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается
пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости,
последнюю можно использовать для изготовления стандартной
сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По
доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через
воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он
имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как
указано выше.
Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего
сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в
"Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления
стандартной сыворотки системы АВО".
IX. ДАЛЬНЕЙШАЯ ОБРАБОТКА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О ПРИГОДНОСТИ СЫВОРОТКИ, ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ЛЮБЫХ
ИСТОЧНИКОВ
1. Серологические исследования.
В сыворотке определяют:
а) групповую принадлежность (групповые агглютинины);
б) гемолизирующие свойства;
в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию;
г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее
выраженность;
д) титр агглютининов.
Методы исследования (см. пункт IV).
На основании этих исследований делают предварительное
заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями
являются скорость наступления агглютинации и титр антител.
2. Сыворотку предварительно считают пригодной, если она
вызывает агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее, чем
через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее, чем через 1
минуту и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по
отношению к эритроцитам групп А1 и В, и не ниже, чем 1:16 по
отношению к эритроцитам группы А2.
При этом также следят за тем, чтобы сыворотка не имела красной
или бурой окраски.
Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов
ниже, сыворотку считают непригодной.
Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих
свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее
непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (пункт XI).
3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных
в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал
регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной
сыворотки".
X. КОНСЕРВИРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у
донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и
признанную предварительно годной, консервируют.
Наиболее пригодным консервантом является борная кислота,
которую прибавляют из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид
натрия 1 г на 1 мл.
После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок
10-12 дней. За этот срок в ней, с одной стороны, может снизиться
титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз
или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку,
имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить
изотоническим раствором NaCl до титра не ниже 1:64 и
соответственно количеству разводителя добавляют борную кислоту или
азид натрия.
XI. ПЕРВЫЙ КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ ДО РОЗЛИВА И ОЦЕНКА
ПРИГОДНОСТИ ЕЕ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ ОБРАБОТКИ
1. Первый контроль производится через 10-12 дней после
поступления сыворотки, ее предварительного испытания и
консервирования. Он заключается в следующем:
а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е.
сверяют записи на флаконе и в журнале;
б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных
эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на
флаконе и в журнале;
в) одновременно с определением групповой принадлежности
проверяют способность сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не
помутнела и не потемнела ли она;
д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления
агглютинации и титр агглютининов;
е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в
журнал.
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки
делается при следующих условиях: если паспортные записи
произведены правильно, в сыворотке нет признаков инфицирования,
если она не помутнела, не потемнела и обладает достаточной
активностью.
Под достаточной активностью при первом контроле понимают
соответствие требованиям, указанным в разделе II, б при условии,
что титр не только соответствует этим требованиям, но и не
снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными
цифрами.
Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной
для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10-12 дней, после чего
производят второй контроль (см. п. XIV).
При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр
сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32),
сыворотку считают непригодной.
При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения
и помутнения сыворотку считают непригодной.
При первом контроле сыворотки явления неспецифической
агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому
что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с
консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает
сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как при
некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени,
предшествующему второму контролю сыворотки.
XII. УСТРАНЕНИЕ СВОЙСТВА СЫВОРОТКИ ВЫЗЫВАТЬ
НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ АГГЛЮТИНАЦИЮ
Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее
изотоническим раствором NaCl. Это допускается только для сыворотки
групп О(I), А(II) и В(III) и только при высоком титре агглютининов
в ней - не ниже, чем 1:64 - и при этом титре не более, чем
половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему
сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной
кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных
разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах.
Наблюдение проводят в течение 20 мин. После подбора разведения,
устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку.
Если разведение изотоническим раствором NaCl не устраняет
неспецифическую агглютинацию, сыворотку считают непригодной.
Разведение сыворотки группы АВ(IV) не допускается. Сыворотку,
вызывающую хотя бы незначительную неспецифическую агглютинацию,
считают непригодной.
XIII. УСТРАНЕНИЕ ГЕМОЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СЫВОРОТКИ
Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее
прогревают при 56ш С в течение одного часа. Если такое прогревание
не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают
непригодной.
XIV. ВТОРОЙ КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ ДО РОЗЛИВА И ОЦЕНКА ЕЕ
ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ ОБРАБОТКИ
1. Второй контроль производят через 10-12 дней после первого
(приблизительно через 20-24 дня после начала обработки сыворотки)
и проводят так же, как первый контроль (см. раздел XI).
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей
обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи
сделаны правильно, сыворотка не инфицирована, не помутнела, не
потемнела, не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза
эритроцитов и достаточно активна.
Под достаточной активностью при втором контроле понимают
соответствие требованиям, указанным в разделе II, б, при условии,
что титр не только соответствует этим требованиям, но и не
снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле.
В других случаях сыворотку считают непригодной.
XV. СМЕШИВАНИЕ СЫВОРОТОК
Для максимального использования сырья и упрощения контроля за
образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких
порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до
розлива (раздел XIX). Предварительно из каждой порции берут по 1-2
мл сыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр
проверяют еще раз через 2-3 дня и, если он не изменился, то
смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым
номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел
XIV).
XVI. ОКРАШИВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Дополнительным условием, предупреждающим ошибки при
определении группы крови, является окрашивание сывороток.
Окрашивание можно производить до фильтрации, если
предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При
использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после
фильтрации.
Сыворотку группы А(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый)
цвет,
сыворотку группы В (III) - в красный цвет,
сыворотку группы АВ (IV) - в желтый цвет (см. дополнение п.
XXX).
XVII. ФИЛЬТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку,
полученную из крови, взятой непосредственно у донора, обычно
достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку,
полученную из других источников, необходимо фильтровать через
фильтр Зейтца со стерилизующей прокладкой. Такое фильтрование
просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции.
Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение
2).
XVIII. ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ О ПРИГОДНОСТИ
СЫВОРОТКИ
Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после
ее фильтрования.
Сыворотку считают пригодной, если она:
а) специфична, т.е. содержит агглютинины альфа или бета, или
оба вместе и не вызывает неспецифической агглютинации эритроцитов;
б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в
течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение
одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не
ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем
1:16 по отношению к эритроцитам А2.
Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме
абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (см.
раздел XI, первый контроль и раздел XIV, второй контроль);
в) не оказывает на эритроциты гемолизирующего действия;
г) прозрачная. Допускается небольшая опалесценция;
д) предохранена от инфицирования консервированием;
е) имеет точную паспортизацию.
При соответствии этим требованиям сыворотке присваивается
номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная
изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с
соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной
стандартной сыворотки системы АВО".
XIX. РОЗЛИВ
Сыворотку групп О альфа бета(I), Абета(II) и Вальфа(III)
разливают во флаконы или ампулы по 1-5 мл, сыворотку АВ (IV) - по
0,5 мл.
Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в
одном помещении.
Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают
этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают.
XX. ПАСПОРТИЗАЦИЯ РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ
1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой
сывороткой, должны содержать следующие сведения:
а) название учреждения, в котором изготовлена сыворотка;
б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием
агглютининов;
в) номер серии;
г) титр агглютининов в сыворотке. Титр альфа-агглютинина
указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки
группы О альфа бета (I) указывается титр только одного агглютинина
альфа или бета и из них того, который слабее;
д) срок годности: число, месяц, год;
е) на этикетке наносят по диагонали цветные полосы:
для группы А(II) - две синие,
для группы В (III) - три красные,
для группы АВ (IV) - четыре желтые.
2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя
свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и
срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива.
Форму этикетки - см. Рисунок 1.
3. Сыворотку, разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в
"Журнале для регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО".
+------------------------------+ +--------------------------+
| Наименование учреждения - | | Наименование учреждения -|
| изготовителя | | изготовителя |
+------------------------------+ +--------------------------+
| Изогемагглютинирующая | | Изогемагглютинирующая |
|сыворотка группы Оальфабета(I)| |сыворотка группы Абета(II)|
| АНТИ - (А + В) | | АНТИ - В |
|Серия ..... Титр ....... . | |Серия ..... Титр ........ |
|мл ....... годна до .... . | |мл ....... годна до ..... |
+------------------------------+ +--------------------------+
+-----------------------------+ +---------------------------+
| Наименование учреждения - | | Наименование учреждения -|
| изготовителя | | изготовителя |
+-----------------------------+ +---------------------------+
| Изогемагглютинирующая | | Изогемагглютинирующая |
|сыворотка группы Вальфа (III)| | сыворотка группы |
| АНТИ - А | | АВо (IV) |
|Серия ..... Титр ...... .. | | Серия ..... |
|мл ....... годна до ... .. | | мл ....... годна до ..... |
+-----------------------------+ +---------------------------+
Рис. 1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих
сывороток системы АВО.
На этикетки наносят по диагонали цветные полосы:
- для сыворотки группы Абета (II) - две синие;
- для сыворотки группы Вальфа (III) - три красные;
- для сыворотки группы АВо (IV) - четыре желтые.
Возможно печатать таким же цветом полностью текст этикеток.
XXI. СРОК ГОДНОСТИ СТАНДАРТНОЙ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ
Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев
с момента ее розлива.
Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить и при
условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см.
раздел XVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца.
XXII. КОНТРОЛЬ РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ
Контроль разлитой сыворотки производят в пределах срока ее
годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в
лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как
образцы для последующего контроля.
Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и
сохранения ее специфичности и активности.
При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие
требования:
а) отсутствие помутнения, выпадения осадка и потемнения;
б) отсутствие способности вызывать неспецифическую
агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не
позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не
позднее, чем в течение одной минуты;
г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при
втором контроле сыворотки до розлива.
Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота
его не ниже требований, указанных в разделе II, б, то сыворотку
проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не
снижается, сыворотку считают пригодной.
XXIII. МЕТОДИКА ТИТРОВАНИЯ ПРИ КОНТРОЛЕ РАЗЛИТОЙ
СЫВОРОТКИ
При контроле разлитой сыворотки титр можно определять более
простым способом. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим
раствором NaCl соответственно указанному на ней титру. Например,
при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического
раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки.
Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну
каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну
маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных
эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с
сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в
течение пяти минут.
Если за это время появилась агглютинация, значит, титр
сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация не
наступила, значит, титр сыворотки снизился. В этих случаях для
установления величины титра сыворотку титруют вновь, как указано в
разделе IV, 5.
XXIV. БРАК РАЗЛИТОЙ СЫВОРОТКИ В ПРЕДЕЛАХ УКАЗАННОГО
СРОКА ГОДНОСТИ
Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она не
соответствует предъявляемым требованиям (см. раздел XXII, а, б, в,
г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют.
В учреждения, в которые эта сыворотка была отпущена,
немедленно сообщают по телефону или телеграфом о непригодности
данной серии сыворотки.
Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за
непригодности, ликвидируют так же, как сыворотку этой серии,
оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей.
XXV. ВЫДАЧА СЫВОРОТКИ
Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых
определяют группу крови.
Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп
Оальфа бета(I), Абета(II) и Вальфа(III). Сыворотку группы АВо(IV)
выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех
групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают
инструкцию по использованию (см. п. XXIX, дополнение 1).
XXVI. ХРАНЕНИЕ СЫВОРОТКИ
Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при
комнатной температуре или в холодильнике при 4-8 ш С. Если
сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть
использована после полного ее оттаивания.
XXVI. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПАСПОРТИЗАЦИИ СЫВОРОТКИ
Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех
сведений о находящейся в нем порции исходного материала, из
которого получается сыворотка, и последовательную запись всех
результатов, полученных при исследовании исходного материала, а
затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля.
Паспортные записи производятся:
а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно
пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и
исследования этой порции сыворотки;
б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой
сывороткой;
в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для
изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО".
XXVIII. ПАСПОРТНЫЕ ЗАПИСИ В ЖУРНАЛАХ
а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для
изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все
сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотке,
включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива
сыворотки.
При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под
новым номером.
Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с
неразлитой сывороткой.
в) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки
системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива.
В этот журнал вносят сведения, имеющиеся на этикетке разлитой
сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и
результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же
журнал записывают, куда и сколько было отпущено сыворотки каждой
серии.
Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут
независимо от групповой принадлежности сыворотки.
Дополнение N 1
XXIX. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО
(прилагается при выдаче сыворотки)
Техника реакции.
Определение группы крови АВО производится стандартными
изогемагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной
температуре.
Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со
смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у
предварительно надписанного обозначения. Во избежание ошибки при
каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток
каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель
в следующем порядке по горизонтали: Оальфа бета(анти-(А+В)),
Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А).
Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле,
приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с
каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой
стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые
промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.
Результат реакции
Наблюдение за ходом реакции производят при легком покачивании
пластинки в течение пяти минут.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным (+)
или отрицательным (-).
Положительный результат (+) выражается в агглютинации
(склеивании) эритроцитов - агглютинаты видны невооруженным глазом
сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в
более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно
обесцвечивается.
При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно
окрашенной.
Агглютинация наступает обычно в течение 10-30 секунд, однако
наблюдение проводят не менее пяти минут ввиду возможности позднего
наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности
эритроцитов (А2 или А2В).
По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в
эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического
раствора NaCl для разрушения иногда наступающей ложной
агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том
числе в так называемые монетные столбики.
В тех случаях, когда положительный результат получается со
стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для
исключения неспецифической агглютинации производится
дополнительное контрольное исследование испытуемых эритроцитов со
стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых
агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы
АВо(IV) позволяет учесть положительный результат реакции с
сыворотками Оальфа бета(I) (анти-А+В), Абета(II) (анти-В) и
Вальфа(III) (анти-А) как истинный.
+----------------------------------------+----------------------+
|Изогемагглютинирующие сыворотки группы | |
+----------------------------------------+ Исследуемая кровь |
|Оальфа бета(I) Абета(II) Вальфа(III) | принадлежит к группе |
|Анти-(А+В) Анти-В Анти-А | |
+----------------------------------------+----------------------+
| - - - | О(I) |
| - - - | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + - + | А(II) |
| + - + | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + + - | В(III) |
| + + - | |
+----------------------------------------+----------------------+
| + + + | |
| + + + | |
| | |
|Контроль с сывороткой группы АВо(IV) | АВ(IV) |
+----------------------------------------+----------------------+
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови
при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие ее.
--------------------------------
Примечание.
1. При использовании сывороток с титром не ниже, чем 1:64,
разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров
и больных одной серией сывороток каждой группы. При повторном и
перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной
серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий,
которые были применены при первичном определении.
2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные
ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп
крови системы АВО".
Дополнение N 2
XXX. ПОДГОТОВКА И ПРИМЕНЕНИЕ КРАСОК ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ
СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК
Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются
следующие красители:
- для сыворотки группы Абета(II) - метиленовая синяя,
бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них,
взятые в равных количествах;
- для сыворотки группы Вальфа(III) - эозин (ВА), эозин натрия
или конгорот;
- для сыворотки группы АВо(IV) - уранин (флуоресцеин
растворимый - динатрий флюоресцеинат).
Краски растворяют в дистиллированной воде или изотоническом
растворе NaCl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл
жидкости). Краситель приготавливают исходя из потребности 50-100
мл и сохраняют для использования.
При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования
соответствующие растворы красок добавляют по 3-5 капель на каждые
100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или
сине-зеленый для группы Абета(II), светло-красный для группы
Вальфа(III) и желтый для группы АВо(IV).
Следует иметь в виду, что иногда при хранении запаянных ампул
на свету синяя краска в сыворотке группы Абета(II) слегка
выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы
(флакона).
Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на
титр и срок их годности.
"Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих
сывороток для определения групп крови системы АВО", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 года
N 05-14/26, считать утратившей силу с момента утверждения данной
инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 3
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО ПРИ
ПОМОЩИ СТАНДАРТНЫХ ИЗОГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК
Введение
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания
антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по
отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В, и два
агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств
образуют четыре группы крови: Оальфа бета(I), Абета(II),
Вальфа(III) и АВо(IV).
Возможны два способа определения группы крови:
1. Определение группы крови при помощи стандартных
изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови
устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из
этого, делают заключение о групповой принадлежности исследуемой
крови.
2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е.
одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих
сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как
и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и
кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают
наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается
сделать переливание крови, определяется сертифицированным
специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки
процедуру взятия крови и определения группы повторяют.
Результат определения группы крови записывается в правом
верхнем углу лицевого листка истории болезни с указанием даты и за
подписью специалиста, производившего определение.
Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным
специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи
стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй
раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом,
т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток (также двух
различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов.
Результат обоих определений записывается на лицевой стороне
донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц,
определявших группу крови.
Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток
с титром не ниже, чем 1:64, разрешается проводить первичное
определение группы крови у доноров и больных одной серией
сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении
можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже,
чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены
при первичном определении.
Специальное оснащение
а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп Оальфа
бета(I), Абета(II), Вальфа(III) и стандартная сыворотка группы
АВо(IV).
б. Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III).<*>
--------------------------------
<*> - Стандартные эритроциты приготавливаются учреждениями
службы крови в консервированном виде. Можно использовать и
нативные свежие стандартные эритроциты, приготовленные малыми
дозами в соответствии с действующей инструкцией по их
изготовлению.
в. Изотонический раствор NaCl.
г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со
смачиваемой поверхностью.
д. Пипетки.
е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания
капель крови и сыворотки.
Подготовительная работа
а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим
освещением при температуре 15-25ш С.
б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив
с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий
сыворотки каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы
Оальфа(I), в средние - сыворотку группы Абета(II) и в правые -
сыворотку группы Вальфа(III). В ампулы опускают сухие чистые
пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы АВо(IV), употребляемую в
качестве дополнительного контроля (см. раздел IV, в). Этот набор
дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NaCl.
в. Для определения группы крови перекрестным способом кроме
стандартных сывороток подготавливают также стандартные эритроциты
групп О(I), А(II) и В(III). Пробирки со стандартными эритроцитами
устанавливают в маленький (на три гнезда) штатив в следующем
порядке: слева - группы О(I), в середине - группы А(II) и справа -
группы В(III).
г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток
подготавливают стаканы с водой и с изотоническим раствором NaCl.
Техника определения группы крови
при помощи стандартных сывороток
а. На левой стороне пластинки надписывают Оальфа
бета[анти-(А+В)], в середине - Абета(анти-В) и справа -
Вальфа(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у
которого определяют группу крови.
Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку
наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки
соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух
различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые
образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо:
Оальфа бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А).
Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после
того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу
с сывороткой, из которой она была взята.
б. Кровь для исследования берут из места укола мякоти пальца
или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл
последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку,
каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой
крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества
стандартной сыворотки, с которой она смешивается).
в. Другой стеклянной палочкой перемешивают каплю крови с
сывороткой группы Оальфа бета[анти-(А+В)] до тех пор, пока смесь
не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой
перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы
Абета(анти-В) и так же поступают с сывороткой Вальфа(анти-А). При
использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду.
Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но
в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать
палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать.
г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на
1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.
Наблюдение за ходом реакции проводят на менее пяти минут. Хотя
агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, наблюдение
следует вести и далее - до пяти минут ввиду возможности более
поздней агглютинации, например, с эритроцитами группы А2(II).
д. По мере наступления агглютинации, но не ранее, чем через
три минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых
наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл)
изотонического раствора NaCl и продолжают наблюдение при
периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов реакции
при определении группы крови
при помощи стандартных сывороток
Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть
положительной или отрицательной.
При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунд
от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным
глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из
склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более
крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка
полностью или почти полностью обесцвечивается.
При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут)
остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней
не обнаруживается никаких агглютинатов.
Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы
должны совпадать.
Результаты с сыворотками трех групп: Оальфа бета[анти-(А+В)],
Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А) могут дать четыре различные
комбинации положительных и отрицательных реакций (см. табл. 1).
а. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию,
т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без
признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит
агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I).
б. Если сыворотки групп Оальфа бета[анти-(А+В)] и
Вальфа(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы
Абета(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит
агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II).
в. Если сыворотки групп Оальфа бета[анти-(А+В)] и
Абета(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы
Вальфа(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит
агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III).
г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию,
это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба
агглютиногена - А и В и принадлежит к группе АВ (IV). Однако в
этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности
исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное
контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV).
Для этого на пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) сыворотки
группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл)
каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после
чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании
пластинки. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле, при наличии
ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп Оальфа
бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А), позволяет
считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе
АВ(IV).
Техника определения группы крови
перекрестным способом при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток и
стандартных эритроцитов
а. Определение группы крови перекрестным способом заключается
в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах
испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых
агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных
эритроцитов.
б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме
стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы
О(I), А(II) и В(III).
в. Кровь для исследования берут из вены или места укола
пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в
покое на 20-30 минут для отделения сыворотки (для лучшего
отделения сыворотки через 3-5 минут следует отделить сверток от
стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой).
г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю
часть которой наносят обозначения слева направо: Оальфа
бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и Вальфа(анти-А). На верхнем крае
надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу
крови.
д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку
наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных
изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных
сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6
капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке
слева направо: Оальфа бета[анти-(А+В)], Абета(анти-В) и
Вальфа(анти-А).
е. На правую часть пластинки также под соответствующими
обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле
стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: О(I),
А(II) и В(III).
ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают
сыворотку (острожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают
ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные
эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки
эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл)
капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки.
з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с
эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают,
затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически
покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти
минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно
начинается быстро (10-30 секунд).
Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со
стандартными эритроцитами, может наступить поздно (к концу пятой
минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в
исследуемой сыворотке агглютининов.
и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3
минуты, в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной
капле (0,05 мл) изотонического раствора NaCl и продолжают
наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов при определении группы крови
перекрестным способом
Учет реакции производится путем сопоставления результатов,
полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных
эритроцитов (см. табл. 2).
Результаты реакций, полученных при помощи стандартных
сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е.
указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов,
соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут
быть выражены в четырех различных комбинациях.
а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие
групповых агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови
к группе О(I) (см. раздел IV, а). При этом сыворотка исследуемой
крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными
эритроцитами группы О(I) и положительную - с эритроцитами групп
А(II) и В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови
агглютиногенов альфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность
исследуемой крови к группе Оальфа бета(I).
б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV, б). При
этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп О(I) и А(II), но положительную с
эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой
крови агглютинина бета, т.е. подтверждает принадлежность
испытуемой крови к группе Абета(II).
в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
определяется наличие агглютиногена В (раздел IV, в). При этом
сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со
стандартными эритроцитами групп О(I) и В(III), но положительную с
эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследуемой
крови агглютинина альфа , т.е. подтверждает принадлежность
испытуемой крови к группе Вальфа(III).
г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови
устанавливается наличие агглютиногенов А и В, а исследование с
контрольной сывороткой группы АВ(IV) подтверждает специфичность
реакции (см. раздел IV, г). При этом сыворотка исследуемой крови
дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех
групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой
крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе
АВо(IV).
Причины ошибок и меры их предупреждения
Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным
заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови.
Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок
расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах,
ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное
соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение
времени, необходимого для проведения реакции (5 минут), не
использование контрольной реакции с сывороткой группы АВо(IV),
загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а
также использование недоброкачественных стандартов, например,
сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной),
загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может
вызвать неспецифическую реакцию агглютинации и т.д.
Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к
неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой
отдельной капле. Последнее может заключаться в следующем:
Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не
произошло, в то время как она фактически есть или должна
появиться.
Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла
агглютинация, в то время как она фактически отсутствует.
Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при
фактическом наличии агглютинации, может произойти:
а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или
бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные
сыворотки мало активны, или от того, что эритроциты исследуемого
лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном
наличии этих двух причин агглютинация может совсем не появиться,
например, если малоактивная сыворотка группы Вальфа(анти-А) не
дает агглютинации с эритроцитами группы А(II), если
агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2.
Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции
не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в
которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с
активными сыворотками, агглютинирующая способность которых
проверена, соответствует требованиям инструкции и в пределах срока
ее годности;
б) при избытке крови, если взята слишком большая капля.
Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема
исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных
эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10;
в) при высокой температуре (выше 25ш С) окружающего воздуха,
например, в жаркую погоду (см. раздел II, а).
Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется
группа крови, следует охладить.
Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при
фактическом отсутствии агглютинации, может произойти:
а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные
столбики", которые невооруженным глазом можно принять за
агглютинаты.
Во избежание этой ошибки необходимо добавление изотонического
раствора NaCl (см. раздел III, д) с последующим покачиванием
пластинки,что, как правило, уничтожает "монетные столбики";
б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или
панагглютинации.
Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определения
групп крови при температуре ниже 15ш С (см.раздел II, а) и
обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см.
раздел IV, г);
в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей
неспецифическую агглютинацию.
Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы
(флаконы) со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в
ней имеются помутнение или признаки высыхания;
г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не
покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут
образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию.
Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать
пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III, г и
раздел V, з).
Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной
капле можно сделать неправильное заключение о групповой
принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в
штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по
определению групповой принадлежности следует тщательно проверять
расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а
также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую
принадлежность, номер серии и дату годности.
Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата
необходимо повторное определение группы крови при помощи
стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются
неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных
сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным
способом.
Примечание 1. При определении групповой принадлежности крови
больных в лечебных учреждениях могут встретиться трудности,
вызванные изменением свойств крови при различных патологических
состояниях. Это может выразиться в неспецифической
агглютинабельности эритроцитов, например, при аутоиммунной
гемолитической анемии, у новорожденных с гемолитической болезнью,
у больных циррозом печени, с ожогами, при гнойно-септическом
состоянии. При некоторых заболеваниях, например, при лейкозах,
наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно
группы А(II), а также снижение активности групповых
агглютининов.
В таких случаях определение групповой принадлежности крови
больного должно производиться повторно с использованием
стандартных сывороток более высокой активности, желательно в
лабораторных условиях.
Примечание 2. При использовании для определения групп крови
системы АВО моноклональных антител следует руководствоваться
специальной инструкцией, которая прилагается к комплектам
моноклональных антител при их выдаче.
+--------------------------------------+----------------------+
|Изогемагглютинирующие сыворотки группы| |
+--------------+---------+-------------+ Исследуемая кровь |
|Оальфа бета(I)|Абета(II)| Вальфа(III) | принадлежит к группе |
|Анти-(А+В) | Анти-В | Анти-А | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| - | - | - | О(I) |
| - | - | - | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + | - | + | А(II) |
| + | - | + | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + | + | - | В(III) |
| + | + | - | |
+--------------+---------+-------------+----------------------+
| + + + | |
| + + + | |
| | |
|Контроль с сывороткой группы АВо(IV) | АВ(IV) |
| - | |
+--------------------------------------+----------------------+
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови
при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие ее.
+--------------------------------------+ +--------------------------------------+
| Изогемагглютинирующие | | Изогемагглютинирующие |
| сыворотки группы | | сыворотки группы |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
|Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III)| |Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III)|
|Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А | |Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
| - | - | - | | + | - | + |
| - | - | - | | + | - | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+-----------+
| Стандартные эритроциты | | Стандартные эритроциты |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+-----------------+
| О(I) | А(II) | В(III) | | О(I) | А(II) | В(III) |
| - | + | + | | - | - | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+-----------------+
|Исследуемая кровь группы О(I) | |Исследуемая кровь группы А(II) |
+--------------------------------------+ +--------------------------------------+
+--------------------------------------+ +-------------------------------------+
| Изогемагглютинирующие | | Изогемагглютинирующие |
| сыворотки группы | | сыворотки группы |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
|Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III | |Оальфа бета(А+В)|Абета(II)|Вальфа(III|
|Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А | |Анти-(А+В) | Анти-В |Анти-А |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
| + | + | - | | + | + | + |
| + | + | - | | + | + | + |
+----------------+---------+-----------+ +----------------+---------+----------+
| Стандартные эритроциты | | Стандартные эритроциты |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+----------------+
| О(I) | А(II) | В(III) | | О(I) | А(II) | В(III) |
| - | + | - | | - | - | - |
+----------------+---------+-----------+ +----------+---------+----------------+
|Исследуемая кровь группы В(III) | |Исследуемая кровь группы АВ(IV) |
+--------------------------------------+ +-------------------------------------+
Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови
перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток
двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.
"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную
Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 г. N 05-14/27,
считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 4
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ<*>
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ЦОЛИКЛОНОВ АНТИ-А, АНТИ-В И АНТИ-АВ
ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЖИДКИХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ
ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ АВО (АНТИТЕЛА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ
АНТИ-А, АНТИ-В, АНТИ-АВ)
ТУ 9398-205-27575295-94
1. Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для
определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях
гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с
поликлональными иммунными сыворотками.
2. Характеристика и основные свойства цоликлонов
анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя
мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М.
Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей
анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой
смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология
изготовления реагента исключает возможность его контаминации
патогенными для человека вирусами.
--------------------------------
<*> - Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор
ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.
Оловникова, Е.В.Белкина.
3. Техника определения групп крови человека
системы АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в
консервант: в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из
пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: и
на пластине или планшете. Определение группы крови производится в
помещении с хорошим освещением при температуре 15-25ш С.
3.1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными
пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой
капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
3.2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле
исследуемой крови (0,01-0,03 мл).
3.3. Смешайте кровь с реагентом.
3.4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при
легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут.
Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые
3-6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более
позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые
разновидности антигенов А или В.
3.5.Результат реакции в каждой капле может быть положительным
или отрицательным. Положительный результат выражается в
агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны
невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро
сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля
остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней
не обнаруживаются.
3.6. Интерпретация результатов реакции агглютинации
исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
+---------------------------------+---------------------------+
| Результат реакции<*> | |
| с Цоликлоном: | Исследуемая кровь |
+----------+---------+------------+ принадлежит к группе <**>|
| анти-А | анти-В | анти-АВ | |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| - | - | - | О(I) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| + | - | + | А(II) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| - | + | + | В(III) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
| + | + | + | АВ(IV) |
+----------+---------+------------+---------------------------+
--------------------------------
<*> - Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие агглютинации.
<**> - Окончательно АВО принадлежность устанавливается только
по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на
эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
4. Контроль специфичности реакции агглютинации
В составе Цоликлонов нет высокомолекулярных добавок, способных
вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не
требуется проведение контроля с растворителем. При положительном
результате реакции агглютинации со всеми тремя Цоликлонами
необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию
исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну
каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического
раствора. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при
отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
5. Форма выпуска
Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5-10
мл. Цоликлон анти-А - красного цвета, анти-В - синего и анти-АВ -
бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия в
конечной концентрации 0,1%.
6. Хранение
Срок хранения - два года при температуре 2-8ш С. Вскрытый
флакон можно хранить при температуре 2-8ш С в закрытом виде в
течение одного месяца.
7. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности,
неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев,
получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными
сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения,
номер серии, причины, по которым реагент признан негодным.
Необходимо также приложить протокол с результатами проверки
реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона с
Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ
диагностических жидких для определения групп крови человека
системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)",
утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома
России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
Приложение N 5
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.1998 г. N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИЗГОТОВЛЕНИЮ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОК
И РЕАГЕНТА АНТИРЕЗУС
Стандартные сыворотки антирезус служат для определения
резус-принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц,
сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные
резус-антитела.
Источники получения сыворотки антирезус
Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть
получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во
время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные
реакции или осложнения, которым производят кровопускание в
процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же
лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для
переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них
обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально
иммунизированных антигеном резус. (см. Метод. рекоменд.
"Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина
антирезус").
Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену и
содержащих в крови резус-антитела
Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у
женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится
персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь
резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При
выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в
учреждения Службы крови.
Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к
резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких
женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоиммунных
лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских
консультациях и в учреждениях Службы крови.
Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся
резус-антитела
У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может
быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.
Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода.
Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую
психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка.
Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена
сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении
детей с таким же заболеванием.
При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать
состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия
крови.
В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по
окончании периода лактации, желательно привлечение женщин,
иммунизированных во время беременности, к систематическому
донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в
соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации
доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".
Показатели пригодности крови для изготовления из нее
стандартной сыворотки антирезус
Показателем пригодности крови для приготовления из нее
стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр
резус-антител.
Ввиду возможного снижения титра антител при обработке
сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых
содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные
требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных
антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител
при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже, чем 1:128,
а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или
реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.
Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного
универсального реагента должен быть не ниже 1:32.
Методы и дозы взятия крови
Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену
предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от
искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых
соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам,
дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах,
предусмотренных этой инструкцией.
Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать
также методом плазмафереза, однако только вне периода
беременности.
Оплата на усиление питания лицам, из крови которых
изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови
и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в
тройном размере.
Первичная обработка сыворотки и плазмы
При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза
плазма не позже, чем через 2-3 дня, должна быть дефибринирована.
Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон,
добавляют в нее 20% раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100
мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через
несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут флакон
с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и
оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают
в холодильник при температуре 4-8ш С. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной
кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия -
1 г на 1 л.
Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через
несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30
минут флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и
оставляют на 2 ч. при комнатной температуре, после чего помещают в
холодильник при температуре 4-8шС. На следующий день сыворотку
отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком
титре резус-антител можно получить дополнительное количество
сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для
этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают
его до половины объема изотоническим раствором NaСl или сывороткой
группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным
разводителем или альбумином.
Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают
пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше
вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в
холодильник при температуре 4-8ш С. На следующий день
сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике
до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой
сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител.
Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв
соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают
далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из
расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л.
Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NaCl
применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается
последующее использование сыворотки антирезус реакцией
агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией
конглютинации с применением желатина или полиглюкина.
После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4-8 ш С
не менее 2-3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.
Исследование сыворотки
Исследование сыворотки следует производить через 2-3 недели
после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период
может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с
проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО.
Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с
сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка,
полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем
группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител
альфа и бета. Если это будет установлено, то делают
соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в
сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов,
описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие
резус-антител".
Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных
эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы
О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, C
и E, а также два образца резус-отрицательных (ccddee) эритроцитов.
Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и
отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в
сыворотке резус-антител. После этого сыворотку титруют тем же
методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если
сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют
в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в
непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее
титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной
при использовании обоих методов, она титруется также с помощью
двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию
сыворотки на наличие резус-антител").
Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и
исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если
при этом антитела достаточно активны. Активность антител
определяется их титром, который на этом этапе исследования должен
быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в
непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением
желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не
ниже 1:32.
Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4-8ш С еще не менее 2
недель, после чего повторно титруют.
Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус
принадлежит к группе Оальфа бета(I), Абета(II) или Вальфа(III),
для удобства последующего использования ее рекомендуется
абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав
таким образом ее универсальной.
Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или
анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.
После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь
исследуют и титруют, как сказано выше.
Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических
рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности".
Повторное титрование сыворотки
Повторное титрование сыворотки производят, используя метод,
который дал положительный результат при первом исследовании
сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем
на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр,
указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.
Стандартизация сыворотки антирезус
Стандартизация заключается в исследовании специфичности
антител и в определении пригодности ее для практического
использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью
того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в
сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами
одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены
резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDee,
Ccddee и ccddEe, и резус-отрицательными - ccddee. В число
резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не
содержащих факторов Даффи (Fy) и Келл (К). Если при стандартизации
сыворотка дает положительный результат со всеми образцами
резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной
структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddee, ccddEe
и резус-отрицательными - ссddee, то значит в сыворотке содержатся
резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены
антитела специфичности анти-D, то ее титруют при использовании
того же метода.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с
эритроцитами Ссddee или ccddEe, но дает отрицательный результат с
эритроцитами ccDee и с резус-отрицательными - ccddee, то это
значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или
анти-Е.
Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при
помощи которого они были выявлены.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат
одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а
также с эритроцитами Ссddee и ссddEe, но отрицательный результат
со всеми резус-отрицательными эритроцитами ccddee, то это значит,
что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем
антигенам резус, т.е. анти-D+C анти-D+E или анти-D+C+E.
Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при
использовании которых они оказались активными.
Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той
же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть
соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их
титрование следует проводить, используя разные методы.
Если исследуемая сыворотка дала положительный результат
избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в
ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или
анти-Келл.
Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по
изготовлению сывороток редких групп".
Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического
использования, если она содержит одно или несколько резус-антител
в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой
среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для
реакции с применением желатина или полиглюкина
Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается
использование таких сывороток с более низким титром при условии
хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки,
отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками
данной специфичности.
Назначение сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть
использована в зависимости от формы установленных в ней антител:
реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением
желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.
Кроме того, сыворотка, содержащая неполные резус-антитела,
может быть использована для приготовления стандартного
универсального реагента антирезус с применением 33% раствора
полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п.
16).
Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для
практического использования, должны быть расфасованы и
паспортизированы.
Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус
После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки
фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2-5 мл,
в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеиваются
этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии,
обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы
антител антирезус и срока годности.
Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус
Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в
холодильнике при 4-8ш С или в замороженном состоянии при -15ш С и
ниже.
При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет
свойств в течение 2 лет.
При размораживании или хранении ее при 4-8ш С срок годности
устанавливают 4 мес.
Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и
дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть
проверены (см. п. 10) и при сохранении их специфичности и титра
срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном
состоянии - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4-8ш С
- на 2 месяца.
+------------------------------++------------------------------+
| Наименование учреждения- || Наименование учреждения- |
| изготовителя || изготовителя |
| || |
| Сыворотка АНТИРЕЗУС || Сыворотка АНТИРЕЗУС |
+------------------------------++------------------------------+
+------------------------------++------------------------------+
| анти- ..... неполные антитела|| анти- ....... полные антитела|
| для метода ..................|| для метода ..................|
| Группа крови ........ || Группа крови ........ |
| Серия ........ ..... мл || Серия ........ ..... мл |
| Годна до ......... || Годна до ......... |
+------------------------------++------------------------------+
Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.
На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по
диагонали цветные полосы:
для сыворотки группы А(II) - синие;
для сыворотки группы В(III) - красные;
для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной
- желтые.
Выдача стандартной сыворотки антирезус
При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо
приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это
особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по
форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов
исследования, активны только при применении определенного метода и
будут неактивными или неспецифическими при неправильном их
использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см.
дополнения 1, 2, 3.
Изготовление стандартного универсального реагента антирезус
для определения резус-принадлежности в пробирках без
подогрева
Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для
определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой
принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток,
содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных,
исследованных и признанных пригодными как стандартные (см. п.п.
6-11).
Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV)
или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов
альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические
рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой
специфичности").
Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с
титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более
высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32
изотоническим раствором NaCl, сывороткой группы АВ(IV) или
стандартным универсальным разводителем (см. Методические
рекомендации "Приготовление сыворотки-разводителя и стандартного
разводителя").
Титрование сывороток производят с применением 33% раствора
полиглюкина.
В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и
т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического
раствора NaCl.
Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли
исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после
перемешивания содержимого, переносят 2 капли во вторую, из третьей
- в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус -
положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33% раствора
полиглюкина.
Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4-6 доноров
группы О(I) резус-положительной, взятой не более, чем за 2-3 дня.
Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем
наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно
поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам
пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании
пробирок продолжают 3 минуты.
Через 3-5 минут во все пробирки добавляют по 2-3 мл
изотонического раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 1-2
кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом
или через лупу.
Оценку результата производят по наличию или отсутствию
агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне
полностью или частично обесцвеченной жидкости.
Последнее разведение, в котором имеется агглютинация
эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.
Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже
1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят
пробный образец реагента.
Изготовление пробного образца реагента антирезус
К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами
добавляют 1 объем 33% раствора полиглюкина, тщательно перемешивают
и далее проводят исследование в отношении специфичности и
активности.
Исследование на специфичность и активность
Пробный образец реагента исследуют с 2-3 образцами
резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными
ccddee группы О(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование
включают эритроциты генотипа Ccddee и ccddEe. Среди
резус-отрицательных должны быть образцы, положительные и
отрицательные по факторам Даффи (Fy) и Келл (К).
Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов
эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2
капли исследуемого реагента и затем, в соответствии с маркировкой,
в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок
тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до
горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как
сказано выше.
Трактовка результата
Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации
эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.
Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с
D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой
отдельной пробирке.
Если агглютинация произошла во всех пробирках с
резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными
образцами и образцами Ссddee и ссddEe - реакция отрицательная,
пробный образец считают специфическим.
Активность пробного образца можно оценивать одновременно с
оценкой специфичности.
Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась
при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и
через 3 минуты после добавления изотонического раствора NaCl
агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью
просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на
предыдущем этапе исследования, не ниже 1:32, реагент считают
пригодным для практического использования.
Изготовление полного объема (серии)
стандартного универсального реагента антирезус
После заключения о пригодности пробного образца можно готовить
стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из
потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же
методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и
делают заключение о его пригодности.
После этого реагент фильтруют, разливают по 2-5 мл во флаконы
или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и
наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего
реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока
годности.
+------------------------------------+
| Наименование |
| учреждения-изготовителя |
+------------------------------------+
| Универсальный реагент антирезус |
| анти- ................. |
|для метода в пробирках без подогрева|
| Серия ......... .......... мл |
| Годен до .............. |
+------------------------------------+
Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального
реагента антирезус.
Хранение и срок годности
Реагент хранят в холодильнике при 4-8ш С.
Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента
контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.
Выдача стандартного универсального реагента антирезус
Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с
33% раствором полиглюкина и с инструкцией по использованию (см.
дополнение 2).
Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента
антирезус
Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных
для разных методов определения резус-принадлежности, а также
реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации
материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки
антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной
сыворотки антирезус".
Дополнение N 1
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ РЕАКЦИЕЙ
С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция с применением желатина пригодна для работы с
сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.
Общие замечания.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.
Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально
приготовленной- универсальной определяют резус-принадлежность в
эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус
группы О(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах
группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы О(I) и
А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы
О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную
пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию,
инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается
небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует
употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно,
следует встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого
натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом
случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить
доверху изотонический раствор NaCl, содержимое ее перемешать и
центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок
объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов
эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных
и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет
исследоваться.
б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно
маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в
контрольные пробирки - по одной капле (0,05 мл) стандартных
резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных
резус-отрицательных эритроцитов.
в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10%
раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в
теплой воде (46-48ш С). Перед употреблением желатин следует
просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при
потере свойств застудневать при 4-8ш С желатин непригоден.
г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05
мл) сыворотки антирезус.
2-ой ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за
счет аутоантител.
д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с
пробирками помещают в водяную баню при 46-48ш С на 15 минут или в
суховоздушный термостат при той же температуре на 30-45 минут.
е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них
доливают 8-10 мл изотонического раствора NaCl и перемешивают
содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в
виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне
жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно
окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
считают резус-положительными (Rh+), образы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).
Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после
проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и
активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации
со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной
группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после
просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго
(контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие
агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на
неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител
и, следовательно, положительный результат с сывороткой на
антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции
солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым
изотоническим раствором NaCl, для элюирования с них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо
выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их
несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности, и, по
возможности, сывороткой с полными антителами.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела
анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются
только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих
антигенов, т.е. фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и Сw
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике
реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок
см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение N 2
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОГО УНИВЕРСАЛЬНОГО РЕАГЕНТА
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ В ПРОБИРКАХ БЕЗ
ПОДОГРЕВА
(Прилагается при выдаче реагента)
Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит
групповых агглютининов аьфа и бета и поэтому может быть
использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой
группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности
реагента антирезус необходимо одновременно с основным
исследованием ставить контроль, используя стандартные
резус-положительные и стандартные резус-отрицательные эритроциты.
Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных
эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая
непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и
осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови,
взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых
эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных
исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица,
кровь которого исследуется.
б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл)
изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора
полиглюкина.
2-й ряд служит контролем для исключения возможной
неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например, за
счет аутоантител.
в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят
согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови
(эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и
резус-отрицательные (rh-) эритроциты.
г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем
медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального
положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки.
Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более
выраженной.
Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение
первой минуты, но для образования устойчивости комплекса
антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду
возможности замедленной реакции при слабовыраженной
агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом
при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического
раствора NaCl и перемешивают содержимое путем 2-3 - кратного
переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через
лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев
из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости
исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При
отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное
окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной
(rh-).
Однако эти результаты можно учитывать как истинные только
после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной
реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и
отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами,
а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во
всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду
указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за
счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с
сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует
применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку
антирезус с полными антителами или предварительно отмытые
эритроциты теплым изотоническим раствором NaCl для элюирования с
них аутоантител.
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой
активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами
в реакции солевой агглютинации.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их на резус-положительных и
резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно
исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В
число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь
которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа
ccddee.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится
сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности.
Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в
различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
Дополнение N 3
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СТАНДАРТНОЙ СЫВОРОТКИ АНТИРЕЗУС
АНТИ-D ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
РЕАКЦИЕЙ АГГЛЮТИНАЦИИ В СОЛЕВОЙ СРЕДЕ
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с
сывороткой, содержащей полные резус-антитела.
Общие замечания.
Определение резус-фактора следует проводить двумя сериями
стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции
описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием
одной и той же методики-агглютинации в солевой среде.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать
групповую специфичность сыворотки по системе АВО.
Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная -
универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности
крови любой группы по системе АВО.
Сывороткой группы О(I) определяют резус-принадлежность только
в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах
группы О(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах
группы О(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований
необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки
антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные
резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что
и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты
обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных
эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные
пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора
лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На
пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от
которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в
пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое
их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после
свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество
свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует
интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества
эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как
сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего одну
каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную
пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NaCl. Такую
взвесь употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8ш С.
Техника реакции.
а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2-2,5 см с
внутренним диаметром 0,5-0,6 см и с гладким дном округлой формы в
каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для
контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом
бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые
устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге
надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий
лунки с круглым дном;
б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле
(0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки)
2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой
серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора
NaCl;
в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок)
добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси исследуемых
эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси
стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле
взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;
г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают
втряхиванием и помещают в термостат при 37ш С на 1 час. (Можно
затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1-2 часа
до учета результатов).
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в
контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над
источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации
эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается
на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или
зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными,
они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях
эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более
светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается
равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с
небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой
правильно очерченный круг.
Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при
положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D,
- резус-положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие
агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).
Однако результаты можно учитывать как истинные только при
совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки
контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность
сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со
стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы
и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными
эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Примечания.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие
слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно
исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой
активности. Антиген крови Du в реакции солевой агглютинации не
выявляется.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров
недостаточно разделения их только на резус-положительных и
резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо
дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С
и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица,
кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е.
фенотипа ccddee.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е
производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей
специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом
виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и
определение резус-антигена D. В качестве контролей используются
эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах
предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению
резус-принадлежности крови".
"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента
антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07
сентября 1990 года N 05-14/28, считать утратившей силу с момента
утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
Минздрава РФ
А.И.ВЯЛКОВ
